Разработка нитроксильных спиновых зондов и меток для биофизических и биомедицинских исследований Кирилюк И.А.

Нитроксильные радикалы в биологии Исследование динамики и взаимодействий в молекулярных системах Контрастирующие агенты для МРТ Функциональные зонды (ЭПР-оксиметрия, рН, концентрация тиолов, NO, Redox статус) Терапевтические применения (антиоксиданты, СОД-миметики) 2

рН-Чувствительные спиновые зонды 3

Разработчики новых технологий ЭПР и двойного протон-электронного резонанса NMR/EPR applications group of the Department of Biomedical Physics of Aberdeen University David J. Lurie Margaret A. Foster 4

Продольно регистрируемый ЭПР (LODESR) (a) Эффект Оверхаузера в циклически изменяющемся магнитном поле (FC-DNP) (b) a b - нужны новые спиновые зонды Высокочувствительные к физиологически важным параметрам Достаточно устойчивые in vivo, чтобы проводить измерения Новые методы спектроскопии, пригодные для измерений in vivo : 5

V. V. Khramtsov and L. B. Volodarsky, In Biological Magnetic Resonance, Vol. 14; Berliner, L. J., Ed.; Plenum Press: New York, 1998, 109. pH-чувствительные спиновые зонды 6

Имидазолидиновые НР pK = 2.5 – 4.7 7

4-Амино-2,5-дигидроимидазол-1-оксилы 7-15% 5-25% 3-4% pK 6.1 pK pK

Предложенная ретросинтетическая схема 9

Исходные соединения 10

3 A: 25% NH 3 +EtOH; B: NH 4 OAc + MeOH; C: NH 3 + MeOH Синтез 1-гидрокси-2,5-дигидроимидазолов

Синтез 4Н-имидазол-5-карбонитрил-3-оксидов

Реакции 4Н-имидазол-5-карбонитрил-3- оксидов с нуклеофильными агентами 11

Реакции 4Н-имидазол-5-карбонитрил-3- оксидов с нуклеофильными агентами 12

Синтез 4-амино-2,5-дигидроимидазол- 1-оксилов Суммарный выход 20-50%

V. V. Khramtsov and L. B. Volodarsky, In Biological Magnetic Resonance, Vol. 14; Berliner, L. J., Ed.; Plenum Press: New York, 1998, 109. N H O O N N O N N O Ph N N O N N H 2 N O N N H O O 2 N HMI ATI HMI 4 ATI 7 pK 6.9 pK 7.2 pK 1 ( a N ) pK 2 ( a N ) 4.8 (0.80) 2.8 (0.60) pK 1 ( a N ) pK 2 ( a N ) 6.1 (0.83) 3.4 (0.35) Кривые титрования синтезированных НР4 14

Использование спинового зонда для измерения рН в желудке крысы с помощью PEDRI/FC-DNP Включено облучение на частоте ЭПР Разность изображений Выключено облучение на частоте ЭПР Гс FC-DNP 15

рН-чувствительные спиновые метки pK=

Нитроксильные радикалы, устойчивые к восстановлению Наблюдаемые скорости восстановления аскорбатом при pH 5.5. [нитроксильный радикал] 1 mM, [аскорбиновая кислота] 100 mM с с -1 L. Marx, R. Chiarelli, T. Guiberteau and A. Rassat, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 2000,

Синтез 2,2,5,5-тетраэтил-замещённых имидазолиновых нитроксильных радикалов 18

рН-чувствительные спиновые зонды устойчивые к восстановлению pK = 6.1pK = 7.3pK = 7.4pK = 4.7pK = 4.95 В 1 mM растворе аскорбата, pH 7.5 В крови крысы 19

k red = 1.31 M -1 s -1 rat = 108 min k red = 4.4 M -1 s -1 rat = 79 min Новый спиновый зонд для мониторинга рН в желудке k red = 0.85 M -1 s -1 rat = 16.6 min HMI k red = 22.5 M -1 s -1 ATI 20

Алкилирующие спиновые метки и гидрофильные спиновые зонды pK 6.68 (2R=(CH 2 ) 4 ) pK 6.2 (R=Me) 21

Инкапсулирование спинового зонда в липосомы NR2 Грамицидин А Восстановление в гомогенате сердца крысы с добавлением 10 мМ сукцината NR2 в липосоме свободный NR Гс на единицу 22

Калибровка спинового зонда на низкопольном ЭПР-спектрометре при 37 °C a N, G 23

Измерения в изолированно сердце крысы при ишемии/реперфузии Time, min Потеря интенсивности сигнала менее 10% от первоначальной за 30 мин Time, min IPC + I/R I/R 24

Измерение рН и падение интенсивности сигнала ЭПР в молочной железе мыши и в опухолях MET-1 Средние значения рН L-band ЭПР pH микроэлектрод В опухоли6.60± ±0.05 В молочной железе 6.98± ±0.07 EPR signal, A.u. В молочной железе В опухоли 25

Синтез частично дейтерированного спинового зонда 26

VRF PEDRI томография для измерения рН 27

Томограмма внеклеточной рН в мыши, полученная с помощью VRF PEDRI Среднее значение рН L-band ЭПР pH микроэлектрод VRF PEDRI В Опухоли6.60± ± ±0.1 В молочной железе 6.98± ± ±0.1 28

k red = 0.04 k red = 0.65 pK = 6.1 pK = 6.3 2R(S),4R(S) Новые имидазолидиновые спиновые зонды 29

Спектры ЭПР имидазолидиновых НР 30

Данные расчётов Gaussian-98 3 B3LYP/6-31G* Атомы с высокой спиновой плотностью 31

Дейтерированные имидазолидиновые спиновые зонды R=CH 3 (1/3); CD 3 (2/3). 32

Спектры ЭПР обычных и частично дейтерированных НР R=CH 3 (1/3); CD 3 (2/3). 33

Константы скоростей восстановления имидазолидиновых НР аскорбатом 34

Корреляция между константами скоростей с аскорбиновой кислотой (k Asc ) и с 1-(трет-бутоксикарбонил)- этильным радикалом (k c ) 35

Синтез пирролиновых НР со спироциклогексановыми фрагментами в окружении N-O группы 36

Синтез пирролиновых НР со спироциклогексановыми фрагментами в окружении N-O группы 37

38

Затухание спинового эха при температуре 106 К Kathirvelu, V.; Smith, C.; Parks, C.; Mannan, M. A.; Miura, Y.; Takeshita, K.; Eaton S. S.; G. Eaton, R. Chem. Commun. 2009, 454–

Спиновые метки для адресного введения 40

Константы скоростей восстановления НР аскорбиновой кислотой 41

208 A.A.Bobko, I.A.Kirilyuk, I.A.Grigorev, J.L.Zweier, V.V.Khramtsov. Free Radic. Biol. Med., 2007, V. 42, P Обратимость восстановления НР аскорбиновой кислотой [208] 0.1 mM, pH

Константы скоростей прямой и обратной реакций k 1,M -1 с ± ± ± ±0.05 k -1,M -1 с -1 (5±1) 10 3 (1.1±0.2) 10 3 (2.3±0.5) 10 3 (1.1±0.2)×10 5 K 1 = k 1 /k -1 (1.7±0.2) (1.0±0.3) (1.0±0.4) (4.5±0.4)

CPH- 15 N PСА- 15 N NR Реакция обмена атомом водорода