Молекулярно-генетическая организация междисков политенных хромосом Drosophila melanogaster

Политенные хромосомы слюнных желез D. melanogaster Митотические хромосомы -

Возможные свойства междисков Образованы регуляторными участками генов Выполняют барьерные функции при разделении хромосом на структурно-функциональные домены Содержат постоянно активные гены «домашнего хозяйства» Являются районами инициации репликации

Трансгенные линии мух, использованные для ЭМ картирования ЛинияТранспозон /Локализация Новый диск Источник получения линии Adh hs61C Adh hs82B pHAP / 61С ; 3L pHAP / 82B ; 3R ++++ J. Bonner 28X-C, 28X-F 28-term 28X / 42F ; 2R 28X / 1B ; Х 28term / 97A ; 3R V.Corces HB 194 HB 73 HB 59 HB 23 cHB -194 / 84E ; 3R cHB -73 / 12E ; Х cHB -59 / 8E ; Х cHB -23 / 9E ; Х J. Lis R310.1R310.1 / 93AB ; 3R+G.Rubin ICon-3C(1A) ICon-3C(5F) ICon-3C(8E) ICon-3C(67B) ICon-3C(79D) pICon-3C / 1A ; Х / 5F ; Х / 8E ; Х / 67B ; 3L / 79D ; 3L С. Демаков П. Зимин ICon(dv)-61C (84F) ICon(dv)-61C (87C) pICon(dv)-61C / 84F; 3R / 87C; 3R ++++ С. Демаков

Линия Adh hs61C Контроль ТШ - ТШ 3 ТШ 5 Р-транспозоны в составе хромосом формируют новые структуры

Линия HB -194 Контроль ТШ - ТШ 3 ТШ 5 ТШ 1 Линия HB -194 Р-транспозоны в составе хромосом формируют новые структуры

Линия 12 Контроль Линия 2 Контроль

ЛинияТранспозон /Локализация Новый диск Источник получения линии Adh hs61C Adh hs82B pHAP / 61С ; 3L pHAP / 82B ; 3R ++++ J. Bonner 28X-C, 28X-F 28-term 28X / 42F ; 2R 28X / 1B ; Х 28term / 97A ; 3R V. Corces HB -194 HB 73 HB 59 HB 23 cHB -194 / 84E ; 3R cHB -73 / 12E ; Х cHB -59 / 8E ; Х cHB -23 / 9E ; Х J. Lis R310.1R310.1 / 93AB ; 3R+G. Rubin ICon-3C(1A) ICon-3C(5F) ICon-3C(8E) ICon-3C(67B) ICon-3C(79D) pICon-3C / 1A ; Х / 5F ; Х / 8E ; Х / 67B ; 3L / 79D ; 3L С. Демаков П. Зимин ICon(dv)-61C (84F) ICon(dv)-61C (87C) pICon(dv)-61C / 84F; 3R / 87C; 3R ++++ С. Демаков РlArB / 86B ; 3R / 85D ; 3R / 60E ; 2R / 3A ; X Л. Омельянчук Трансгенные линии мух, использованные для клонирования ДНК междисков

Молекулярно-генетическая организация хромосом в районах исследованных междисков

E 1L 2L EP A SG (kb) актин PlArB rpl 19 60E-2,1S Анализ транскрипционной активности междисков 60E RpL19 карта района зонд Нозерн-блот гибридизация

E 1L 2L EP A 61C 85D86B 61C-3,8HB85D-2,2R86B-1,3RS актин Анализ транскрипционной активности междисков RE64518banCG33936Stich 1 карта района зонд Нозерн

Генетическая организация междисков 1. Междиски образованы постоянно активными белок-кодирующими генами «домашнего хозяйства» 2. Междиски с очень низкой транскрипционной активностью содержат 5-некодирующие участки генов, неактивных в слюнных железах

1 kb MNase Карта района Зонды Саузерн- гибридизация BrEt ДНК из диска 10A1-2 Ib0Ib1Ib2Ib3 Нуклеосомная организация междиска 61С7/С8 Ib0Ib1Ib2Ib3

Междиски содержат матрикс-связывающие участки ДНК MAR из кластера гистоновых генов 85D86B61C P S RRR,S,XhB,H,R Фрагменты ДНК, перекрывающие междисковые районы

Использованные в работе виды Drosophila 2-5 м.л.н м.л.н м.л.н.

ДНК из районов междисков D. melanogaster имеет высокую гомологию с ДНК из видов подгруппы melanogaster 61C-3,8HB85D-2,2R3A-1,8P 60E-2,1S86B-7,0R3C-4,6R mrvf

D. melanogaster / D. simulans – 0.7%-1.8% /D. mauritiana – 0.8%-1.9% /D. teissieri – 0.8%-1.6% /D. erecta – 0.7%-1.5% Сходство нуклеотидных последовательностей D. melanogaster/ D. simulans – 96,4% / D. mauritiana – 96,3% / D. teissieri – 92,2% / D. erecta – 92,6% D. simulans п.н. D. mauritiana п.н. D. teissieri п.н. D. erecta п.н. Консенсус 3224 п.н. Длины нуклеотидных последовательностей Скорость накопления нуклеотидных замен за 1 миллион лет Характеристика ДНК видов подгруппы melanogaster, гомологичных ДНК междиска 61С7/C8

ins pHAP RE Adf-1 BEAF-32 п.н. Анализ последовательности ДНК междиска 61С7/C8 методом филогенетического футпринта

Фактор транскрипции Adf-1 связывается с ДНК междиска 61С7/C8 in vivo Линия с IWS FISH Линия с EPs FISH Контроль Adf-1 Контроль Adf-1 Линия с IWS Adf-1 Линия с EPs Adf-1

IB rosy pUC19 white lacZ P P Возможные варианты морфологии хромосомы в районе встройки транспозона Вырезание IB ДНК по FRT-сайтам FLP- рекомбиназой FRT

rosy pUC19 whitelacZ P hsp70 P FRT Междисковая ДНК автономна в различном генетическом окружении pICon-3C Линия ICon-3C(8E) Контроль Линия ICon- (8E) 1,5 kb ТШ- ТШ+ ТШ- ТШ+

rosy pUC19 white lacZ P P FRT d-verm pICon(dv)-61C Линия ICon(dv)-61C(84F) Контроль Линия ICon(dv)- (84F) hsp70 4,7 kb ТШ- ТШ+

Выводы 1. Проведен широкий комплексный анализ молекулярно-генетической организации основных структур политенных хромосом – дисков и междисков. 2. С помощью трансформации генома дрозофилы Р-элементами, содержащими фрагменты ДНК с известными молекулярными характеристиками, впервые проведено моделирование хромосомных структур - дисков, междисков и пуфов. Установлено, что морфологическое разнообразие этих структур определяется степенью компактизации и протяженностью фрагментов ДНК, образующих Р-транспозоны. Показано, что в составе политенных хромосом Р-транспозоны расположены преимущественно в районах междисков или очень близко к ним. 3. Реализован новый подход, основанный на использовании Р-транспозонов в районах междисков в качестве молекулярных зондов для клонирования ДНК междисков и изучения их молекулярно- генетической организации. С помощью этого подхода впервые проведено клонирование ДНК из 12 районов междисков. 4. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК междисков позволил сделать следующие заключения: а) все последовательности являются уникальными в составе генома дрозофилы; б) во всех последовательностях обнаружены характерные участки, обладающие высоким потенциалом связывания с белками ядерного матрикса. Для ДНК междисков 61С7/С8, 85D9/D10 и 86B4/B6 связывание с ядерным матриксом показано экспериментально; в) значительная часть междисковых районов образована некодирующими участками генома: 9 районов содержат межгенные спейсеры или 5- и 3- концы генов, что указывает на возможные регуляторные функции этих последовательностей ДНК; 2 района представлены некодирующими экзонами генов и один район содержит интрон гена. Гены в районах междисков различаются по функциям и особенностям экспрессии в онтогенезе.

5. На основании данных об информационном содержании междисков и анализе их транскрипционной активности развито и обосновано представление о функциональной гетерогенности междисков. Полученные в работе факты позволяют выделить два функционально различных типа организации этих структур. Междиски первого типа образованы небольшими постоянно активными белок-кодирующими генами домашнего хозяйства. Междиски второго типа проявляют очень низкую транскрипционную активность и представлены 5 -регуляторными районами генов, неактивных в слюнных железах. 6. На примере междиска 61С7/С8 показано, что хроматин междисковых районов имеет нуклеосомный уровень организации в составе политенных хромосом слюнных желез, а также в большинстве личиночных тканей. Эти наблюдения позволяют заключить, что различия в степени компактизации ДНК дисков и междисков связаны с более высокими уровнями организации хроматина. 7. Сравнительный филогенетический анализ ДНК междисков с геномными ДНК из разных видов дрозофил показал, что нуклеотидные последовательности ДНК этих районов в целом эволюционно лабильны. Обнаружено, что нуклеотидная последовательность ДНК из междиска 61С7/С8 эволюционирует со скоростью, близкой к скорости нейтральной эволюции в подгруппе melanogaster. Такая эволюционная нестабильность предполагает либо отсутствие каких-либо важных функций для междиска, либо необязательность сохранения строгого порядка расположения нуклеотидов для выполнения его возможных функций. Показано, что наиболее вероятно последнее предположение: методом филогенетического футпринта в составе последовательности ДНК этого междиска выявлены эволюционно консервативные участки, которые могут иметь функциональное значение. В частности, были обнаружены области, содержащие возможный промотор и сайты связывания фактора транскрипции Adf-1 и инсуляторного белка BEAF-32. Связь этих белков с ДНК междиска 61C7/C8 показана экспериментально.

8. Впервые показана принципиальная возможность детального изучения механизмов формирования хромомерного рисунка хромосом с помощью моделирования междисковых структур в составе политенных хромосом трансгенными методами в комбинации с сайт-специфичными системами рекомбинации. С помощью этих систем получены данные, которые свидетельствуют об автономности декомпактного состояния исследованных междисков: а) встраивание протяженных фрагментов ДНК из междисков 3С6/C7 и 61С7/С8 в другие районы хромосом в составе транспозона pICon приводит к образованию новых междисков, тогда как точная эксцизия этих фрагментов вызывает удаление данных междисков и слияние дисков, сформированных из материала транспозона ; б) особенности организации хроматина в районах междисков 3С6/C7 и 61С7/С8 воспроизводятся и в составе инсерций, содержащих ДНК из этих районов.

Семешин В.Ф Ватолина Т.Ю. Горчаков А.А. Жимулев И.Ф. Зимин П.И. Зыков И.А. Шароглазова И.В. Шварц Ю.Б. Шлома В.В. Разин С.В. Юдинкова Е.С. Участники исследований Институт цитологии и генетики Новосибирск Институт биологии гена Москва

Спасибо за внимание !!!