Огиенко Анна Александровна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИЙ ГЕНА TRITHORAX-LIKE И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ООГЕНЕЗ DROSOPHILA MELANOGASTER Представление диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н. Баричева Э.М. Новосибирск 2006

Введение Оогенез – сложный, многоэтапный процесс, который контролируется скоординированным действием большого числа генов, начиная с эмбриональной стадии и заканчивая взрослой мухой. Ген Trithorax-like (Trl) обеспечивает экспрессию многих генов D. melanogaster. Активная экспрессия гена Trl в яичниках необходима для запасания в растущем ооците. Косвенные данные об участии гена Trl в оогенезе D. melanogaster (анализ гетерозигот и генетических мозаиков).

Целью данной работы является изучение влияния новых мутаций гена Trl на оогенез D. melanogaster. В связи с этим были поставлены следующие задачи: Получить новые гипоморфные мутации гена Trl, влияющие на оогенез дрозофилы, и провести их картирование; Провести анализ влияния этих мутаций на экспрессию гена Trl как на уровне мРНК, так и на уровне белка; Провести анализ влияния этих мутаций на оогенез дрозофилы; Доказать, что именно изменение в экспрессии гена Trl приводит к выявленным нарушениям.

Стрелками указаны сайты инициации транскрипции, используемые в яичниках взрослых мух. Схема 5 района гена Trithorax-like. Локализация мутаций, используемых в работе

Область минимального функционального промотора гена Trl Область минимального промотора указана зеленым пунктиром. Треугольниками показана локализация Р-элементов, в новых аллелях гена Trl.

Анализ экспрессии гена Trl у новых гипоморфных мутаций В яичниках самок Trl 362 выявляется только один транскрипт размером 3 т.н., и суммарное количество мРНК гена Trl снижено как минимум в 10 раз, по сравнению с диким типом. В яичниках гомозиготных Trl en82 мутантных самок транскрипция снижена приблизительно на треть по сравнению с нормой. В яичниках Trl 362(ex) экспрессия гена практически не отличается от нормы. Oregon R – дикий тип, Trl R85 – ноль-аллель гена Trl. 70% 100% >10% ~100%

Анализ влияния новых мутаций гена Trl на фертильность взрослых мух ГенотипСамки ()Самцы () Trl 362(ex) /Trl 362(ex) стерильныфертильны Trl 362(ex) /Trl R85 стерильныфертильны Trl en82 /Trl en82 полустерильныфертильны Trl en82 /Trl R85 стерильныфертильны Trl 362 /Trl 362 стерильныфертильны Trl 362 /Trl R85 стерильныфертильны Trl R85 – нуль-аллель гена Trl

Количество яиц, откладываемое мутантными самками Генотип Среднее кол-во откладываемых одной самкой яиц, шт./сут. Oregon R/Oregon R50,20 Trl 362(ex) /Trl 362(ex) 7,96 Trl 362(ex) /Trl R85 7,94 Trl en82 /Trl en82 2,7 Trl en82 /Trl R85 2,4 Trl 362 /Trl 362 1,5 Trl 362 /Trl R85 1,4

Стадии гибели эмбрионов Trl 362 /Trl 362 Стадии гибели эмбрионов: 60% на стадии синцитиальной бластодермы 18% в течение 8-12 стадии 6-8% на последних стадиях эмбриогенеза 14-16% стадия гибели определена не точно Поскольку 60% эмбрионов гибнут до стадии целлюляризации, т. е. до начала зиготической транскрипции, есть основание предполагать, что гибель эмбрионов связана с нарушениями в оогенезе.

Морфология яиц мух дикого типа и мутантов Trl А – дикий тип (размер яиц более 500 мкм) Б – мутант Trl en82 /Trl R85 (размер яиц мкм) В – мутант Trl 362(ex) /Trl R85 (размер яиц мкм ) У всех мутантов значительно укорочены дорзальные выросты хориона (стрелка). Масштаб 100 мкм.

Изучение жизнеспособности мутантов Относительная жизнеспособность особей генотипа M/Trl R85 при температуре 25 и 29°С, выраженная в процентах (%) от теоретически ожидаемого значения. M/Trl R85 25°С Oregon R84,98±1,12 Trl 362(ex) 70,76±1,37 Trl en82 71,32±3,72 Trl ±2,7 29 °С Oregon R62,98±1,45 Trl 362(ex) 41,81±1,37 Trl en82 41,34±7,6 Trl ±1,6

Локализация белка GAGA в яичниках взрослых мух дикого типа и мутантов Trl 362 Значительно снижена экспрессия белка GAGA в ядрах питающих клеток. GAGA белок обнаруживается только в фолликулярных клетках. фк - фолликулярные клетки, пк – питающие клетки, гер – гермарий, ифк – интерфолликуляные клетки, кт – клетки туники. Поликлональные антитела против белка GAGA были любезно предоставлены профессором В. Пирротта (V. Pirrota) (Женевский Университет, Швейцария) (Poux et al., 2001). Увеличение Х20, Х100

Локализация белка GAGA в яичниках куколок мутантов Trl 362 (А) Локализация белка GAGA в гонадах куколок дикого типа, белок выявляется как в половых, так и в соматических клетках. (Б) Гонады куколок мутанта Trl 362. Белок GAGA обнаруживается в терминальных филаментах (стрелки). Увеличение Х40

Локализация белка GAGA в яичниках взрослых мух слабых гипоморфных мутантов (А) Trl 362(ex) количество белка не отличается от нормы. (Б) Trl en82 количество белка несколько снижено. Масштаб – 100 мкм

Нарушение морфологии яичников Trl мутантов Полученные мутации гена Trl влияют: 1. на структуру овариол 2. на число и структуру половых клеток яичников; 3. на формирование стадиеспецифических актиновых филаментов в половых клетках яичников; 4. на функционирование соматических клеток.

Нарушение морфологии яичников Trl мутантов (нарушение структуры овариол) (А) – овариола яичников мухи дикого типа. (Б, В) - морфология овариол Trl 362 мутантов. Увеличение х40 для (А) и х20 для (Б, В).

Нарушение морфологии яичников Trl мутантов (нарушение числа половых клеток) (А) – яйцевые камеры яичников мухи дикого типа. (Б, В) – яйцевые камеры Trl 362 мутантов. Увеличение х40.

Нарушение числа питающих клеток в яйцевых камерах мутантов Генотип Число просчитанных камер, шт Число камер с нарушениями, шт % камер с нарушениями Oregon R/Trl R ,13 Trl 362(ex) /Trl R ,39 Trl en82 /Trl R ,18 Trl 362 /Trl R ,81 Самое большое число нарушений числа питающих клеток встречается у самого сильного гипоморфного мутанта Trl 362

Нарушение морфологии яичников Trl мутантов (нарушение числа половых клеток) (А) – яйцевая камера яичников мухи дикого типа (виден один ооцит, стрелка) (Б, В) – яйцевые камеры Trl 362 мутантов. Увеличение х40 для (А) и х20 для (Б, В).

Нарушение числа половых клеток в яйцевой камере может быть обусловлено: 1.Нарушением числа делений цистобласта в гермарии. При этом увеличивается процент камер с числом питающих клеток 2 n -1, где n-число раундов деления цистобласта n 4 (1, 3, 7, 31); 2.Нарушением обволакивания сформированной цисты фолликулярными клетками в гермарии. При этом сумма питающих клеток в соседних камерах кратна 15.

Нарушения в функционировании фолликулярных клеток у Trl мутантов ооцит Фолликулярные клетки

Аномальная конденсация хроматина у Trl мутантов. Масштаб – 100 мкм (А) Овариола яичников дикого типа, аномальная конденсация (указана стрелкой) наблюдается в камере на стадии 8. (Б) Овариола Trl мутанта, аномальная конденсация (указана стрелкой) наблюдается на стадии 10. (В) Аномальная конденсация хроматина выявленная с помощью акридин оранжевого. В

А, И, Г масштаб мкм; Б, Г, Е масштаб - 50 мкм. (А, Б) Яйцевая камера самок дикого типа. (В, Г) Яйцевая камера самок Trl 362 мутанта (Д, Е) Яйцевая камера самок Trl 13C /Trl EP(3)3609 О – ооцит. Актиновые филаменты окрашены с помощью FITC- phalloidin, ядра - DAPI. Стрелками указаны ядра питающих клеток, проползающие в кольцевые каналы.

Анализ числа камер с отсутствием цитоплазматических актиновых филаментов у Trl мутантов. Генотип Общее число просчитанных камер Доля камер с нарушениями от общего числа просчитанных камер, % Тrl 362(ex) /Тrl R ,24 Тrl en82 /Тrl R ,35 Trl 13C /Trl ,45 Тrl 362 /Тrl R ,65

Нарушение миграции фолликулярных клеток у Trl мутантов на поздних стадиях развития яйцевой камеры. Масштаб 100 мкм. Дикий тип Trl en82 Trl 362(ex) DAPI фаллоидин

Спасение фенотипа Trl мутантов трансгенными конструкциями, содержащими кДНК гена Trl Яйцевые камеры Trl 362 гомозиготных самок после введенния hsp83: GAGA-519 трансгена Линии, несущие hsp83:GAGA-519 и hsp83:GAGA-581 транспозоны, экспрессирующие кДНК гена Trl, любезно предоставлены Шедлом П. (Принстонский Университет, США) (Greenberg and Schedl, 2001).

Спасение фенотипа Trl мутантов трансгенными конструкциями, содержащими кДНК гена Trl Трансгены Генотип 1х hsp83: GAGA-519 2х hsp83: GAGA-519 1х hsp83: GAGA-581 2х hsp83: GAGA-581 Тrl 362(ex) /Тrl 362(ex) фертильны Тrl en82 /Тrl en82 фертильны Тrl 362 /Тrl 362 фертильны (выживают единичные потомки) фертильныстерильны

Выводы: 1)Получены и прокартированы новые гипоморфные мутации, затрагивающие 5-область гена Trl. Мутация Trl 362 содержит Р-элемент в 5`- некодирующей области гена (в позиции 2979) и прилегающую к нему делецию размером 97 пар нуклеотидов ( ). Делеция удаляет два первых сайта инициации транскрипции, используемых в яичниках. Мутация Trl 362(ex) содержит такую же делецию в 5- некодирующей области гена, как и мутация Trl 362, но не содержит Р-элемент. 2)Проведено картирование мутации Trl en82, которая обусловлена инсерцией Р-элемента размером 1,4 т.п.н. в 5- некодирующую область гена Trl, в позицию )Показано, что вышеперечисленные мутации приводят к стерильности самок, как в гомозиготном состоянии, так и в сочетании с нуль-аллелем, в то время как самцы таких генотипов фертильны.

4)Проведен анализ экспрессии гена Trl в яичниках мутантов. В яичниках самок Trl 362 экспрессия гена Trl снижена как минимум в 10 раз. Транскрипция гена Trl в яичниках гомозиготных Trl en82 мутантных самок снижена приблизительно на треть, тогда как в яичниках Trl 362(ex) мутантов экспрессия гена практически не отличается от нормы. 5)Показано, что у всех Trl мутантов в той или иной степени нарушена морфология овариол и яйцевых камер. Яйцевые камеры мутантов характеризуются отличным от нормы числом половых клеток, в питающих клетках зафиксированы нарушения в формировании цитоплазматических актиновых филаментов. На позних стадиях развития яйцевой камеры у мутантов выявлены нарушения в функционировании соматических клеток. 6)Введение конструкций, экспрессирующих кДНК гена Trl, в геном мутантов приводит к восстановлению фертильности самок, что свидетельствует о том, что именно изменение в экспрессии гена Trl является причиной выявленных нарушений в оогенезе.

Спасибо за внимание!

Локализация белка GAGA в органах и тканях соматического происхождения Слюнная железа, жировое тело и Мальпигиевый сосуд личинок 3-го возраста. Экспрессия не отличается от Oregon R. Наблюдается ядерная локализация GAGA белка. Увеличение Х20, Х40

Нарушение цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках мутантов Гены-мишени для GAGA белка: Act5C - кодирует цитоплазматическую изоформу актина chicadee caping protein beta - кодируют актин связывающиеся белки bifocal При анализе на конфокальном микроскопе было показано, что GAGA сам по себе не является структурным компонентом актиновых филаментов