УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН Федорова Е.В. Получение и анализ мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trithorax-like Drosophila melanogaster Генетика – представление диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н. Баричева Э.М 2009

Цель: выявление и анализ функционально-значимых районов второго интрона гена Trithorax-like D.melanogaster. Задачи : 1. Получение и картирование мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trl D.melanogaster. 2. Молекулярно-генетический анализ полученных мутантов : а) исследование влияния этих мутаций на выживаемость дрозофил при различных температурах содержания мух; б) изучение уровня экспрессии гена Trl у мутантов. 3. Идентификация и анализ функционально-значимых участков второго интрона гена Trl : а) выявление эволюционно-консервативных последовательностей во втором интроне гена Trl; б) выявление сайтов связывания белка GAGA во втором интроне и изучение связывания рекомбинантного белка GAGA и белков эмбриональных ядерных экстрактов с выявленными сайтами.

EP(3)3184 l(3)s2325 ЕN ЕNP PP BNX P E мРНК Треугольниками обозначено место встройки Р-элемента, стрелка внутри треугольника указывает ориентацию транспозона.

Схема получения перестроек по гену Trl с помощью Р-элемент индуцированной рекомбинации у самцов Просмотрено потомков скрещивания Б (в двух экспериментах)

Результаты экспериментов по получению мутаций гена Trl с помощью Р-элемент-индуцированной рекомбинации у самцов ЕР(3) рекомбинанта 83 самца l(3)s рекомбинантов 109 самца Всего получено 158 линий 23 мутации по гену Trl : 13 делеций затрагивают и кодирующую область гена; 7 делеций затрагивают только второй интрон гена; 3 дупликации

- область второго интрона

Цитологическое картирование делеций, затрагивающих ген Trl Trl 3-74 Trl 3-47 Trl 1-25 Trl 3-57 Trl фрагмент карты Бриджеса Oregon R

- область второго интрона

Делеции, удаляющие различные фрагменты второго интрона гена Trl Линия25ºC29ºC ± 1,7***51 ± 3,4 ндр ± 1,5***40 ± 1,2*** ± 1,3***35 ± 1,4*** ± 1,5***12 ± 0,9*** Oregon R85 ± 1,156 ± 1,5 Выживаемость мутантов при различной температуре развития (в % от теоретически ожидаемого значения) *** – Отличие от контроля (Trl R85 /Oregon R) при Р

10-15 м.л.н м.л.н. Виды дрозофил, геномные последовательности которых были использованы для поиска эволюционно-консервативных районов второго интрона гена Trl

L(3)s2325 E(P) Делеции, удаляющие различные фрагменты второго интрона гена Trl п.н. эволюционно-консервативные участки

Еще два консервативных района имеют незначительные вариации в нуклеотидных последовательностях у разных видов дрозофил. 2 : и 7 : 1, длиной 23 п.н. 2 3, длиной 20 п.н. 4, длиной 19 п.н. 5, длиной 17 п.н. 6, длиной 18 п.н. 7 ( - UCSC Genome Bioinformatics Site)

10-15 м.л.н м.л.н. Виды дрозофил, геномные последовательности которых были использованы для поиска эволюционно-консервативных районов второго интрона гена Trl

L(3)s2325 E(P) Делеции, удаляющие различные фрагменты второго интрона гена Trl п.н. эволюционно-консервативные участки сайты гиперчувствительности к ДНКазе I

Nothern-блот анализ экспрессии гена Trl при 29ºС Контроль нанесения РНК – гибридизация с зондом к гену rpl19 Гибридизация с зондом, содержащим константную область кДНК гена Trl (экзоны 2, 3 и 4)

Схема введения транспозонов, экспрессирующих кДНК гена Trl, кодирующие различные изоформы белка GAGA GAGA-трансгены увеличивают выживаемость мутантов Trl 1-72 при 29ºС (по признаку достижения взрослой стадии) Оценка достоверности различий – по критерию Фишера (P>0,999)

L(3)s2325 E(P) Делеции, удаляющие различные фрагменты второго интрона гена Trl п.н. эволюционно-консервативные участки сайты гиперчувствительности к ДНКазе I потенциальные GAGA-сайты

Связывание рекомбинантного белка GAGA, экспрессированного в клетках Е.coli, с олигонуклеотидами: экспериментально подтвержденный GAGA-сайт района bxd PRE гена Ultrabithorax: 5- ccgtatctctccctctctccgcagt- 3 – положительный контроль; 2 - сайт связывания белков семейства FOXA – ( tttg )x6 отрицательный контроль ; 3 - GA1: 5- agaacgagagagtgagacgtagagacagagc -3 ; 4 - GA2: 5- gcagacagagagggagagagcgagagaa -3 ; 5 - GA3: 5- ggagagtgtgagcgacgctcgaccggagt -3.

Связывание белков экстракта ядер эмбрионов дрозофилы с олигонуклеотидом GA1 (5 – agaacgagagagtgagacgtagagacagagc – 3 ): 1 – свободный зонд; 2, 5 – связывание зонда с белками экстракта ядер; 3, 6 – связывание в присутствии 20х избытка немеченого олигонуклеотида GA1; 4, 7 – связывание в присутствии 50х избытка GA Связывание белков экстракта ядер эмбрионов дрозофилы с олигонуклеотидом GA2 (5 – gcagacagagagggagagagcgagagaa– 3 ): 1 – свободный зонд; 2, 7 – связывание зонда с белками эмбрионального экстракта; 3 – связывание в присутствии 10х избытка GA2; 4, 8 – связывание в присутствии 50х избытка GA2; 5, 9 – связывание в присутствии 100х избытка C/EBP; 6, 10 – связывание в присутствии 100х избытка CDC Связывание белков экстракта ядер эмбрионов с олигонуклеотидом GA3 (5 – ggagagtgtgagcgacgctcgaccggagt – 3 ): 1 – свободный зонд; 2, 5 – связывание зонда с белками эмбрионального экстракта; 3, 6 – связывание в присутствии 50Х избытка GA3; 4, 7 – связывание в присутствии 100Х избытка CDC73; 8 – связывание в присутствии 100Х избытка C/EBP. 25ºС29ºС А Б 25ºС29ºС 25ºС29ºС А A Б Б

Выводы: Получено 23 новых аллеля гена Trl и проведено их картирование с помощью молекулярных и цитогенетических методов. 10 мутаций (7 делеций и 3 дупликации) затрагивают только район второго интрона гена Trl. Показано, что удаление фрагмента в центральной части второго интрона гена Trl (делеции Trl 3-85, Trl 3-23 и Trl 3-59 ) приводит к снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при 25ºС относительно нормы на 22, 28 и 32% соответственно. Делеции, удаляющие район в 3-конце интрона (Trl 1-23 и Trl 1-72 ), снижают выживаемость при 29ºС относительно нормы на 49 и 44% соответственно. С помощью Нозерн-блот гибридизации показано, что при 29ºС картина транскрипции гена Trl у мутантов Trl 1-72 отличается от нормы соотношением представленности транскриптов на поздних стадиях эмбриогенеза. Филогенетический анализ последовательностей второго интрона гена Trl двенадцати разных видов дрозофил выявил семь эволюционно-консервативных участков, размеры которых варьируют от 17 до 23 п.н. (из них пять – со 100% гомологией). С помощью метода задержки ДНК-зонда в геле для трех потенциальных сайтов связывания GAGA, предсказанных методом SITECOM во втором интроне гена Trl, показано связывание с ними: а) рекомбинантного белка GAGA, экспрессированного в клетках E.coli ; б) ядерных белков клеток эмбрионов дрозофил. Картина связывания трех GAGA-сайтов с белками экстракта ядер клеток эмбрионов меняется в зависимости от температуры, при которой развивались эмбрионы

Публикации 1.А.В.Катохин, А.В.Пиндюрин, Е.В.Федорова, Э.М.Баричева. Молекулярно- генетический анализ гена Trithorax-like, кодирующего транскрипционный фактор GAGA Drosophila melanogaster. Генетика. 2001, Т.37, 4, С Е.В.Федорова, А.АОгиенко., Д.А.Карагодин, К.Г.Айманова, Э.М.Баричева. Получение и анализ новых мутаций по гену Trithorax-like Drosophila melanogaster. Генетика. 2006, Т.42, 2, С А.А.Огиенко, Д.А.Карагодин, С.А.Федорова, Е.В.Федорова, В.В.Лашина, Э.М.Баричева. Анализ новой гипомофной мутации гена Trithorax-like, влияющей на оогенез Drosophila melanogaster. Онтогенез. 2006, Т. 37, 3, С. 157– Е.В.Федорова, А.В.Пиндюрин, Э.И.Баричева. Поддержание паттернов экспрессии гомеозисных генов в развитии Drosophila melanogaster белками групп Polycomb, trithorax и ETP. Генетика. 2009, т.45, 10, С

L(3)s2325 E(P) Делеции, удаляющие различные фрагменты второго интрона гена Trl п.н. эволюционно-консервативные участки сайты гиперчувствительности к ДНКазе I потенциальные GAGA-сайты