Изучение влияния метки коллоидного золота на способность антител взаимодействовать с вирусом на примере Х-вируса картофеля (ХВК) и вируса табачной мозаики (ВТМ) Матузенко Светлана Работа проводилась в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, в лаборатории иммунобиохимии. Научный руководитель: Сафенкова Ирина Викторовна Москва, 2009 г.

Целью исследования было изучение влияния метки коллоидного золота на способность антител взаимодействовать с вирусом на примере Х-вируса картофеля (ХВК) и вируса табачной мозаики (ВТМ).

Задачи: Изучить взаимодействие вирусов с нативными препаратами антител. Изучить взаимодействие вирусов с нативными препаратами антител. Изучить взаимодействие вирусов и конъюгатов антител с коллоидным золотом. Изучить взаимодействие вирусов и конъюгатов антител с коллоидным золотом. Охарактеризовать изменения взаимодействия антител с вирусами при их иммобилизации на поверхности коллоидного золота. Охарактеризовать изменения взаимодействия антител с вирусами при их иммобилизации на поверхности коллоидного золота.

Гипотеза Иммобилизация антител на коллоидном золоте происходит преимущественно по участкам их поверхностей, не входящим в антиген-связывающие сайты. Иммобилизация антител на коллоидном золоте происходит преимущественно по участкам их поверхностей, не входящим в антиген-связывающие сайты. Поэтому антитела при иммобилизации не теряют функциональности. Общий план строения антител: 1) Fab; 2) Fc; 3) тяжелая цепь; 4) легкая цепь; 5) антиген-связывающий участок; 6) шарнирный участок

В работе использовались Х-вирус картофеля (ХВК) Х-вирус картофеля (ХВК) Вирус табачной мозаики (ВТМ) Вирус табачной мозаики (ВТМ) Моноклональные антитела против ХВК и ВТМ Моноклональные антитела против ХВК и ВТМ Коллоидное золото Коллоидное золото Конъюгат коллоидного золота с антителами Конъюгат коллоидного золота с антителами Конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена. Конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) Метод иммуноферментного анализа (ИФА) Метод электронной микроскопии Метод электронной микроскопии Метод атомно-силовой микроскопии Метод атомно-силовой микроскопии Метод иммуно- хроматографического анализа. Метод иммуно- хроматографического анализа.

Проверка взаимодействия немодифицированных антител с вирусами с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) Схематическое изображение образования иммунных комплексов при проведении ИФА: 1 – лунка, 2 – вирус, 3 – конъюгат антитела с пероксидазой хрена, 4 – антитело Фотография микропланшета

Концентрационная зависимость взаимодействия антител с иммобилизованным ВТМ в системе ИФА

Выводы по ИФА взаимодействия моноклональных антител с ВТМ Количество иммунных комплексов, регистрируемых методом ИФА, зависит от концентрации и антител и вируса, что позволяет проводить выбор антител, наиболее эффективно взаимодействующих с вирусом. Количество иммунных комплексов, регистрируемых методом ИФА, зависит от концентрации и антител и вируса, что позволяет проводить выбор антител, наиболее эффективно взаимодействующих с вирусом. Из трех охарактеризованных антител против ВТМ для дальнейшей работы было выбрано 3G11, связывание которого регистрируется в концентрации до 20 нг/мл. Из трех охарактеризованных антител против ВТМ для дальнейшей работы было выбрано 3G11, связывание которого регистрируется в концентрации до 20 нг/мл.

Получение и характеристика коллоидного золота Гистограмма распределения частиц по диаметру Электронно-микроскопическая фотография препарата коллоидного золота 3D-изображение препарата коллоидного золота (атомно-силовая микроскопия)

Получение конъюгатов коллоидного золота с антителами. Диализ антител Диализ антител Определение концентрации антител по оптической плотности при длине волны 280 нм Определение концентрации антител по оптической плотности при длине волны 280 нм Определение оптимальной концентрации антител для получения стабильных неагрегирующих конъюгатов с КЗ Определение оптимальной концентрации антител для получения стабильных неагрегирующих конъюгатов с КЗ Синтез конъюгатов Синтез конъюгатов Спектрофотометри- ческая характеристика конъюгата Спектрофотометри- ческая характеристика конъюгата Схематическое изображение конъюгата коллоидного золота (2) с антителами (1)

Проверка работы конъюгата с помощью иммунохроматографического анализа

Проверка взаимодействия вирусов и конъюгатов антител методом ИФА Схематическое изображение образования иммунных комплексов: 1 – лунка, 2 – вирус, 3 – антитела, 4 – частица коллоидного золота, 5 – конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена. Схематическое изображение образования иммунных комплексов: 1 – лунка, 2 – вирус, 3 – антитела, 4 – частица коллоидного золота, 5 – конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена.

ИФА взаимодействия ВТМ и немодифицированных антител ИФА взаимодействия ВТМ и конъюгатов коллоидного золота с антителами Сравнение взаимодействия с ВТМ немодифицированных антител и конъюгатов коллоидного золота с антителами

Вывод Антитела, специфичные к вирусам (ХВК и ВТМ), не теряют функциональности при иммобилизации на частицах коллоидного золота. При этом уровень связывания в системе ИФА выше для конъюгированных с коллоидным золотом антител, чем для немодифицированных антител в той же концентрации. Таким образом, наша гипотеза полностью подтвердилась. Антитела, специфичные к вирусам (ХВК и ВТМ), не теряют функциональности при иммобилизации на частицах коллоидного золота. При этом уровень связывания в системе ИФА выше для конъюгированных с коллоидным золотом антител, чем для немодифицированных антител в той же концентрации. Таким образом, наша гипотеза полностью подтвердилась.

Используемая литература Вершигора А.Е. Общая иммунология. // К.: Выща шк С Вершигора А.Е. Общая иммунология. // К.: Выща шк С Галактионов В.Г. Иммунология. // М.: Нива России С Галактионов В.Г. Иммунология. // М.: Нива России С Feinstein A., Rove A.J. Molecular mechanism of formation of an antigen-antibody complex. // Nature V P Feinstein A., Rove A.J. Molecular mechanism of formation of an antigen-antibody complex. // Nature V P Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. // М.: Высш. шк С Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. // М.: Высш. шк С Антитела. Ред. Кэтти Д., М.: Мир Т. 1. С , 39, Антитела. Ред. Кэтти Д., М.: Мир Т. 1. С , 39, Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ.- М.: Мир, С Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ.- М.: Мир, С Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, С Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, С Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Романенко О.Г., Титова Н.А., Трубачева Ж.Н., Чередникова Т.В., Еремин С.А. Твердофазные методы иммуноферментного определения гербицидов симазина и атразина. Прикладная биохимия и микробиология т. 31, N 1, сс Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Романенко О.Г., Титова Н.А., Трубачева Ж.Н., Чередникова Т.В., Еремин С.А. Твердофазные методы иммуноферментного определения гербицидов симазина и атразина. Прикладная биохимия и микробиология т. 31, N 1, сс

Благодарности Я благодарю сотрудников лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха, в частности моего научного руководителя, Ирину Викторовну Сафенкову, за помощь в работе, а так же Сергея Менделевича Глаголева за организацию биопрактики. Я благодарю сотрудников лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха, в частности моего научного руководителя, Ирину Викторовну Сафенкову, за помощь в работе, а так же Сергея Менделевича Глаголева за организацию биопрактики.

Имунноферментный анализ Первый столбец лунок оставлен под контроль, а в остальные добавлено по 100 мкл раствора вируса в ФБ (фосфатный буфер) (для каждой – по две строки). Первый столбец лунок оставлен под контроль, а в остальные добавлено по 100 мкл раствора вируса в ФБ (фосфатный буфер) (для каждой – по две строки). Первый столбец был оставлен под контроль, в следующие раститрованы антитела (по три столбца на каждое антитело) 3G11, 3G1, 2C12. В последние два столбца ничего не добавляли. Первый столбец был оставлен под контроль, в следующие раститрованы антитела (по три столбца на каждое антитело) 3G11, 3G1, 2C12. В последние два столбца ничего не добавляли.

(рН 8,5) IgG-11G (mg/ml) = [(A(280)*10]/1,4= [0,091*10]/1,4 = 0,65 mg/ml

Имунноферментный анализ (8,5 и 9,5 – значения pH конъюгатов) (8,5 и 9,5 – значения pH конъюгатов) (20 и 30 – размер частиц коллоидного золота) (20 и 30 – размер частиц коллоидного золота)