Инициация трансляции у эукариот Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции

Особенности мРНК ПрокариотыЭукариоты Часто полицистроннаОбычно моноцистронна m7G-кеп на 5-конце и длинный поли(А)-хвост на 3-конце Метаболическая нестабильность Образует комплекс с белками, Метаболически стабильнее 2

Особенности инициаторной тРНК Прокариоты N-формил-метионил-тРНК-f (F-Met- tRNAf) (аминогруппа блокируется – тРНК не может участвовать в элонгации) Эукариоты Не формилируется 3 Инициаторная тРНК Мет по структуре отличается от других тРНК

Инициация: как рибосома оказывается на AUG-кодоне 4 Инициация может происходить как недалеко от 5-конца, так и в середине мРНК со стартового кодона (обычно AUG) 30S связывается непосредственно с сайтом инициации Пуриновая SD-последовательность комплементарно спаривается с 16S рРНК -> ассоциация 30S субчастицы с мРНК Белок S1 связывается с мРНК перед SD Прокариоты Эукариоты 3 способа инициации: Модель сканирования: взаимодействия малой субъединицы с кэпом и сканирование 5UTR Инициация на внутренних AUG-кодонах Реинициация (после освобождения полипептида рибосома не диссоциирует)

Инициация: прокариоты 5 Отличительная особенность: Сначала 30S связывается с мРНК в районе старт-кодона, затем к комплексу присоединяется тРНК. Факторы инициации: IF-1 – стабилизация инициаторного комплекса IF-2 + GTP – присоединение к комплексу инициаторной тРНК IF-3 –препятствует ассоциации рибосомы, препятствует узнаванию не AUG-кодона

ПрокариотыЭукариоты Объединение большой и малой субчастиц, ГТФ-азы П: Присоединение Мет-тРНК к 30S Препятствуют инициации с не AUG-кодона Инициация: эукариоты 6 Площадка для связывания многих других факторов Тройной комплекс, имеет высокое сродство к 40S. После гидролиза GTP сродство теряется, фактор eIF2 и GDP отделяются. Обеспечивают активную конформацию малой субчастицы, посадку тРНК в Р-участок Стимулирует гидролиз ГТФ в тройном комплексе

7 Инициация: эукариоты

Инициация у эукариот на внутренних старт-кодонах IRES – internal ribosomal entry sites Обеспечивают внутреннюю инициацию на некоторых мРНК эукариот (в основном используются вирусами) Относительно большие и сложные структуры (в отличие от SD- последовательностей прокариот) Механизм действия: связывание компонентов транскрипционного аппарата Примеры: Пикорнавирусы (полиовирус, вирусы гепатита А, простого насморка, ящура) Связывают 4G, не требует 4E HCV (вирус гепатита C) Связывает 40S, не требует 4F CrPV (вирус паралича сверчка) Связывает 80S, не требует никаких факторов 8

Инициация у прокариот Что влияет на эффективность: Степень комплементарности и длина последовательности SD Вовлечение инициаторной последовательности во вторичные и третичные структуры Регуляция: Репрессия за счет белков, связывающихся с инициаторными районами Вторичная структура может усиливаться связыванием с белками или низкомолекулярными лигандами Riboswitches – связывают низкомолекулярные лиганды (витамины, нуклеотиды и т.п.), производящие «переключение» между различными вторичными структурами 9

Фосфорилирование eIF2 Связывание eIF4E белком 4E-BP С помощью белков, связывающихся с 5UTR и блокирующих сканирование (На примере регуляции мРНК ферритина белком IRE-BP) С помощью белков, связывающихся с 3'UTR С помощью микроРНК 10 Регуляция инициации: эукариоты Глобальная регуляция (модуляция активности основных факторов инициации) мРНК-специфическая регуляция (за счет регуляторных белков или некодирующих РНК, которые связываются с мРНК)

Регуляция инициации: эукариоты Глобальная регуляция (1). Фосфорилирование eIF2 В ответ на различные условия стресса одна из 4 киназ фосфорилирует альфа- субъединицу фактора eIF2 по Ser51 Фосфорилированный eIF2 – ингибитор для eIF2B (за счет слишком плотного связывания) Не происходит реактивации комплекса 11 Фактор eIF2 входит в состав тройного комплекса Комплекс участвует в выборе инициирующего кодона При узнавании инициаторного кодона: eIF2*GTP -> eIF2*GDP + Pi eIF2*GDP не имеет сродства к рибосоме -> отщепляется eIF2*GDP необходимо реактивировать (eIF2B – guanine nucleotide-exchange factor )

Регуляция инициации: эукариоты Глобальная регуляция (1) Противоположное действие фосфорилированного фактора eIF2 GCN4 мРНК в дрожжах Кодируемый белок является транскрипционным активатором генов, регулирующих биосинтез аминокислот Имеет 4 короткие ORF ближе к 5-концу от инициаторного кодона GCN4 Трансляции GCN4 начинается благодаря реинициации 12

eIF4E в составе eIF4F связывается с кэпом, в результате чего комплекс связывается с мРНК eIF4E-binding proteins (4E-BPs) в дефосфорилированной форме конкурируют с eIF4G за связывание с eIF4E -> 4E-BPs ингибируют кэп- зависимую трансляцию 13 Регуляция инициации: эукариоты Глобальная регуляция (2). Связывание eIF4E General 4E-BPs мРНК-специфичные 4E-BPs

14 Регуляция инициации: эукариоты Глобальная регуляция Общая схема

Наиболее изученный механизм мРНК кодирует белок ферритин, отвечающий за связывание излишков железа в клетке. При малом количестве железа вреден. IRE – iron-responsing elements – области мРНК, участвующие в регуляции IRP - IRE regulatory proteins – регуляторные белки (IRE-BP) При недостатке железа IRP связываются со шпилькой IRE в 5 UTR Блокирует сканирование 5UTR 15 Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляция Белки, связывающиеся с 5UTR ( Регуляция мРНК ферритина белком IRE-BR)

16 Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляция Белки, связывающиеся с 3 UTR На примере мРНК церулоплазмина Репрессируется интерфероном-гамма (IFNγ) Фактически ингибитором является сложный комплекс GAIT. Один из составляющих его белков – L13а из 60S IFNγ индуцирует фосфорилирование L13а -> этот белок высвобождается из 60S и присоединяется к GAIT GAIT-комплекс связывается с GAIT- элементом в 3UTR и блокирует посадку 43S на мРНК

Механизм до конца не выяснен Небольшие молекулы ~22 нуклеотида Действуют в комплексе с белками (miRNP или RISC – RNA-induced silencing complex) Комплементарно связывается с 3UTR 17 Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляция Микро РНК (miRNA) Блокирует инициацию трансляции (скорее всего, белки miRNP-комплекса связываются с кэпом, вытесняя факторы eIF4F)