Краткий план лекционного мини-курса «Спектроскопия ядерного магнитного резонанса биомолекул» Лекция 1 Введение в спектроскопию ЯМР Принципы метода и его возможности для изучения биомолекул Аппаратура ЯМР Спектральные параметры и их связь со строением молекул Основные подходы и методики, используемые для изучения строения биомолекул Лекция 2 Методы отнесения сигналов в спектрах ЯМР к группам и атомам аминокислотных остатков белков Установление структуры белков и нуклеиновых кислот методом ЯМР Изучение динамических свойств белков Методы ЯМР для изучения больших биомолекул Перспективы развития метода

Важнейшие области применения спектроскопии ЯМР 1.Изучение строения и свойств органических соединений 2.Определение структуры биомакромолекул 3.Изучение динамических свойств биомолекул 4.Изучение белок-лигандных взаимодействий (ЯМР-скрининг биологически активных соединений) 5.Мониторинг состава биологических жидкостей (метабономика) 6.Визуализация объектов живой и неживой природы (ЯМР- томография) 7.Мониторинг процессов, происходящих в живом организме (in-vivo спектроскопия) 8.Исследование функциональной активности мозга (f-MRI)

Спектроскопия ЯМР – важный инструмент исследования структуры биомолекул

Структура высокого разрешения в растворе для комплекса дигидрофолатредуктазы (16 кДа) с триметопримом и НАДФН

The Nobel Prize in Chemistry 1991 Richard R. Ernst, Switzerland The Nobel Prize in Physics 1952 Felix Bloch, USA Edward Mills Purcell, USA The Nobel Prize in Physics 1944 Isidor Isaac Rabi, USA The Nobel Prize in Chemistry 2002 Kurt Wűthrich, Switzerland Paul C. Lauterbur, USA Sir Peter Mansfield, UK The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2003 За резонансный метод записи магнитных свойств атомных ядер За создание нового метода измерения ядерной магнитной прецессии и последующие связанные с ним открытия За вклад в развитие методологии спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения За развитие методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса для исследования трехмерной структуры биологических макромолекул в растворе За открытия в области визуализации био- объектов

ЗАВОЙСКИЙ Евгений Константинович ( ) 1941 г. - впервые зарегистрировал сигнал ядерного магнитного резонанса 1944 г. - открытие электронного парамагнитного резонанса

Специализированные научные журналы по ЯМР

Важнейшие научные журналы, публикующие ЯМР исследования

Спиновый угловой момент ядра Некоторые ядра обладают спиновым угловым моментом P, который обуславливает появление у этого ядра магнитного момента = P Угловой спиновый момент квантован. Собственные (разрешенные) значения проекции Р z : P z =ħm I где магнитное квантовое число m I =I, I-1, I-2, …, -I I – спиновое квантовое число (свойство ядра) – гиромагнитное отношение (свойство ядра)

Спиновые состояния ядер Протон (p)Нейтрон (n) Спин ядра в основном состоянии E ~ kJ mol -1

Свойства некоторых биологически важных ядер

Магнитные свойства ядер Прецессия ядра, обладающего магнитным моментом в магнитном поле J – момент количества движения – магнитный момент ядра B 0 – магнитное поле

Расщепление энергетических уровней ядра в магнитном поле Магнитные свойства ядер E = ·ħ/2 ·m I ·B o Энергия магнитного диполя в магнитном поле: E = z ·B o для m I = 1 E = ·h /2 ·B o

Частота прецессии ядер (Ламорова частота) E = h E = ·h/2 ·B o ·B o /2 ·B o (частота в Гц) (частота в рад/с)

Области электромагнитного поля

Влияние магнитного поля на ансамбль ядерных спинов Ансамбль ядерных спинов Ансамбль ядерных спинов в присутствии магнитного поля

N /N = exp(- E/kT) При 1.4 T (60 МГц) избыток населенности ядер 1 Н составляет всего 0.001% Поляризация намагниченности ансамбля ядерных спинов При 18.7 T (800 МГц) избыток населенности ядер 1 Н составляет 0.064%

Воздействие радиочастотного импульса на систему ядер, имеющих магнитный момент Поведение ядерных спинов в присутствии переменного электромагнитного поля

Регистрация сигнала Наблюдение сигнала магнитной индукции

Фурье- преобразование Наблюдение сигнала магнитного резонанса Резонансная частота (Ламорова частота) = - B

Схема спектрометра ЯМР

Сердце спектрометра ЯМР - магнит Магнит спектрометра Bruker AVANCE 600 МГц в Центре магнитной томографии и спектроскопии МГУ Магнит спектрометра Varian 900 МГц

Чувствительность эксперимента ЯМР

Чувствительность спектрометра ЯМР S/N ~ 1/T p 1/2 «холодный» датчик

Ампулы ЯМР Ампула Shigemi Обычная ампула 5 мм

Фурье-спектроскопия ЯМР

Измеряемые параметры ЯМР Наблюдаемые параметры Химические сдвиги 1 H, 13 C, 15 N, 19 F, 31 P Интегральные интенсивности сигналов Скорости обмена подвижных протонов на дейтерий Константы спин-спинового взаимодействия (через химическую связь) Ядерные эффекты Оверхаузера (взаимодейств. через пространство) Ширины линий, времена релаксации ядер, кросс-релаксация Константы диполь-дипольного взаимодействия Получаемая из них информация Отнесение сигналов, вторичная структура белка, НК и т.д. Количество измеряемого компонента, кинетические характеристики Положение водородных связей, сворачивание и разворачивание белка и НК Характеристика хим. связей ( 1 J и 2 J ), диэдральные углы ( 3 J), водородные связи ( 2h J и 3h J) Расстояния между ядрами ( 1 H – 1 H < 5A), динамические характеристики ( 1 H – 15 N и т.п.) Динамика, подвижность биомолекулы, конформационные переходы Ориентация белковых доменов и биомолекулы в целом, динамические эффекты

Ламорова частота (частота прецессии ядра): = - B loc B loc = B 0 - B induced Внешнее магнитное поле индуцирует токи электронов Индуцированное локальное магнитное поле Магнитное экранирование ядер

= ( - ref ) · 10 6 / ref - химический сдвиг, м.д. Химический сдвиг B = B o (1- ) - константа экранирования

Спектр ЯМР простого вещества Ванилин

Влияние величины магнитного поля на вид спектра ЯМР

Диапазон химических сдвигов различных ядер

Ароматические протоны (~6-8 м.д.)винильные протоны (~5-6 м.д.) альдегидные протоны (~9-10 м.д.) Кольцевые токи электронов

Спектр ЯМР простого вещества

Взаимодействие ядер Спин-спиновое взаимодействие (посредством системы электронов => через химические связи)

Взаимодействие ядер Спин-спиновое взаимодействие (посредством системы электронов => через химические связи) -CH 2 -CH 3

Вицинальная константа спин-спинового взаимодействия (через 3 связи) Уравнение Карплуса

Взаимодействие ядер Прямое диполь-дипольное взаимодействие D jk ~ 1/r jk 3 (3cos 2 jk – 1) jk В твердых телах или ориентированных средах – расщепление сигналов В жидкостях – скорость релаксации сигнала ЯМР и ядерный эффект Оверхаузера NOE ~ 1/r jk 6

Спектр ЯМР белка

Двумерная спектроскопия ЯМР Фурье-преобразование по t 2 Фурье-преобразование по t 1

Двумерная спектроскопия ЯМР t2t2 t1t1 f2f2 t1t1 f2f2 f1f1

COSY – COrrelated SpectroscopY

2D спектр COSY белка ~ 20 кДа

NOESY – Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY Интенсивность сигнала ~ ЯЭО между протонами i и j ~ 1/r ij 6

NOESY – Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY 1 mM h-DHFR in D 2 O, 800 MHz

Гетероядерная 2D спектроскопия ЯМР

2D спектр гетероядерной ( 15 N- 1 H) корреляции

2D спектр гетероядерной ( 13 С- 1 H) корреляции