Физико-химические методы исследования биологически активных веществ

Лекция 16 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - Жидкостно-адсорбционная хроматография - Жидкостная-жидкостная (распределительная) хроматография (ЖЖХ) Тонкослойная хроматография (ТСХ) –Общее описание метода –Определение величины Rf – Основные правила идентификации с помощью ТСХ- анализа – Методы визуализации хроматографической картины Препаративная колоночная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Высокоэффективная жидкостная хроматография - универсальный метод количественного и качественного анализа смесей соединений всех классов веществ (летучих и нелетучих, термически стабильных и нестабильных, полярных и неполярных) Каждое соединение при данном наборе рабочих условий имеет определенное время удерживания (объем удерживания)

Распространенными видами ВЭЖХ являются: Жидкостно-адсорбционная хроматография (жидкость-твердая фаза) (ЖТХ) Распределительная хроматография (жидкостно-жидкостная) (ЖЖХ) Жидкостно-адсорбционная хроматография Используется для разделения широкого круга неионных соединений, от умеренно неполярных до умеренно полярных Углеводороды, амины, спирты и кислоты Неподвижная фаза - мелкие частицы твердого сорбента (силикагель, окись алюминия) Подвижная фаза (элюент) - органический растворитель k А = n S A / n M A n S A – общее число молекул соединения А, адсорбированных твердым веществом; n M A – общее число молекул соединения А, растворенных в элюэнте.

Активность сорбента ( SiO 2xH 2 O) и гидратированный оксид алюминия (Al 2 O 3 ) Общее правило: чем более полярна молекула, тем сильнее она сорбируется Адсорбционную активность можно регулировать содержанием воды в сорбенте Определение степени активности по Брокману ( значение Rf на силикагеле или оксиде алюминия при использовании элюэнта 20% толуола + 80% петролейного эфира) КрасительСтепень активности IIIIIIVV азобензол п-метоксиазобензол п-аминоазобензол

Сила растворителя Количественно сила растворителя определяется величиной диэлектрической проницаемости ε 0

Жидкостная-жидкостная (распределительная) хроматография (ЖЖХ) Метод применим для разделения практически всех типов соединений, особенно полярных соединений, которые не разделяются ЖТХ Подвижная фаза Неподвижная фаза (жидкость химически связана с твердым носителем) жидкость

Тонкослойная хроматография (ТСХ) Хроматография в тонких слоях, или тонкослойная хроматография имеет огромное значение для: быстрого качественного анализа смесей, контроля хода реакций, определения рабочих параметров для препаративной колоночной хроматографии. Разделение методом ТСХ – одна из форм жидкостно-адсорбционной хроматографии Получение начальной зоны (пятна) должно занимать минимальную площадь!

Тонкослойная хроматография (ТСХ) Величиной, характеризующей данное соединение, является величина Rf Rf - расстояние от линии старта до середины пятна, отнесенное к расстоянию от линии старта до линии фронта растворителя Воспроизводимость величин Rf зависит от сорбента, его пористости (емкости), толщины, насыщения камер, температуры, угла наклона пластины, величины фронта растворителя и получения начального пятна

Основные правила идентификации с помощью ТСХ-анализа 1.Проявительная камера изнутри должна быть выложена фильтровальной бумагой Краевой эффект- искажение хроматографической картины 2. Успех анализа зависит от правильного подбора элюэнта Когда разделению препятствует сильное перекрывание двух пятен, попытайтесь предпринять следующее: а) Изменить химическую природы проявляющего растворителя при сохранении его силы б) Изменить природу неподвижной фазы (замена пластинок) 3. Линии старта и фронта растворителя наносятся простым карандашом на пластинку Высота линии старта должна быть выше уровня растворителя в камере! 4. Исследуемое вещество обычно наносится в виде 1-2% раствора в летучем растворителе (CH 2 Cl 2, эфира) Избегать сильнополярных растворителей! Избегать сильнополярных растворителей! 5. Детектирование пятен хроматограммы проводится подходящим методом

Препаративная колоночная хроматография Воздух под давлением Герметично Элюент Концентрированный раствор (0.1 г в мл) Силикагель Вата

Препаративная колоночная хроматография Р.м

Препаративная колоночная хроматография

Информационные источники Карасек Ф., Клемент Р. введение в хромато-масс-спектрометрию. М.: Мир с. Шарп Дж, госни И., Роули А. Практикум по органической химии. М.: Мир с.