ДНК диагностика фитопатогенов

Методы диагностики Визуальный Индикаторные растения Электронная микроскопия Серологическая диагностика ДНК диагностика

Полимеразная цепная реакция – ПЦР Традиционная ПЦР ПЦР в реальном времени Детекция после ПЦР (end-point detection) Биочипы

ДНК диагностика Сбор материала Экстракция нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) Регистрация сигнала Обработка результатов

Полимеразная цепная реакция – ПЦР После проведения реакции из одной молекулы ДНК образуется миллионы идентичных копий

ДНК диагностика 1.Диагностика урогенитальных инфекций (хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, кандидоз и др.). 2.Вирусные заболевания (гепатиты В и С, вирус папилломы человека, ВИЧ). 3.Детекция микобактерий туберкулеза. 4.Изучение экспрессии генов в различных тканях 5.Анализ SNPs. 6.Детекция трансгенов. 7.Применение в селекции растений. 8.Детекция фитопатогенов.

Детекция фитопатогенов Контроль безвирусного посадочного материала Детекция вироидов Детекция фитоплазм Детекция вирусов в насекомых- переносчиках

Используется с 1995 г.

Диагностика должна быть: Быстрой Дешевой Точной Чувствительной Широко применимой Воспроизводимой

Подходы к диагностике Одновременный анализ большого количества образцов на один фитопатоген Анализ в одном образце большого числа фитопатогенов

Традиционная ПЦР 1.Быстрота анализа. 2.Высокая точность. 3.Воспроизводимость. 4.Простота, легкость в применении. Широкое распространение

Недостатки традиционной ПЦР 1.Длительность. 2.Высокий риск контаминации. 3.Высокие затраты при массовых анализах. 4.Ядовитые реагенты (EtBr). 5.ТРУДОЕМКОСТЬ

1.Молекулярные беконы – структура шпильки. 2.TaqMan-зонды – линейные зонды (Roche Diagnostics). 3.«Скорпион»-зонды – структура шпильки и билинейная (Invitrogen). ПЦР в реальном времени

Молекулярный бекон (Molecular Beacon).

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ БЕКОНЫ

TaqMan-зонд - в процессе проведения ПЦР происходит освобождение флуоресцентной метки ДНК-зонд гибридизуется с амплифицируемой последовательностью ДНК-зонд в процессе амплификации разрушается ДНК- полимеразой и метка начинает флуоресцировать

«СКОРПИОН»-ЗОНДЫ

Сравнение технологий

Используя разные флуоресцентные метки можно детектировать в пробирке разные ПЦР продукты

Детекция флюоресценции Детекция в режиме реального времени (Real-time PCR) Детекция после ПЦР (end-point detection)

Детекция флюоресценции Real-time PCREnd-point detection

Преимущества ПЦР в реальном времени: - все операции проводятся в одной пробирке; - исключается риск контаминации ПЦР- смеси и продуктов; - быстрота анализа; - возможность автоматизации; - экономия затрат времени и труда.

Преимущества ПЦР в реальном времени: Чувствительность В раз более чувствительнее чем ELISA В 100 раз более чувствительнее чем обычный ПЦР

Детекция вироида веретеновидности клубней картофеля PSTVd

Детекция вироида веретеновидности клубней картофеля PSTVd кДНК РНК ОТ-ПЦР Real-time PCR или End-point detection

F R PSTVd Детекция картофельного вироида PSTVd

F R COX

Детекция картофельного вироида PSTVd

Детекция вирусов X и Y картофеля Детекция вируса Y Детекция вируса Х

Детекция вирусов картофеля Сокращение времени детекции в 2 раза Детекция вируса Х картофеля с помощью Real-time ПЦР

Диагностикумы Картофель: Вирусы Х и Y, вирус скручивания листьев картофеля, вироид веретеновидности клубней картофеля Земляника: вирус кольцевого пожелтения жилок листа, вирус крапчатости листьев, вирус слабого краевого пожелтения листа, вирус морщинистости листьев земляники, микоплазмы; Огурец: Вирус огуречной мозаики, вирус зеленой крапчатой мозаики.

Возможность использования в полевых условиях

Экстракция ДНК ПЦР

Биочипы Возможность одновременно детекции более мишеней

Центр молекулярной биотехнологии