Изучение регуляции ростовых процессов каллусной культуры Trigonella foenum – graecum, или пажитника греческого Научный руководитель: доцент, к.б.н. Дитченко Т.И.

Актуальность Растения являются уникальными источниками многих биологически активных соединений. Несмотря на успехи в области применения синтетических лекарств, препараты природного происхождения приобретают все больший вес в практической медицине. Их несомненными преимуществами является широкий спектр биологической активности и экологическая безопасность изготовления, что особенно важно в наше время. Однако в связи с увеличивающимся дефицитом и стоимостью лекарственного растительного сырья, получаемого, как правило, из экзотических, редких и исчезающих видов диких и плантационных растений, на сегодняшний день не представляется возможным полностью обеспечить потребности фармакологической, косметической, а также пищевой промышленности в биологически активных соединениях растительного происхождения. Поэтому в условиях, когда необходимо постоянно увеличивать долю лекарственных субстанций отечественного производства, представляется важным развивать технологии, создающие надежную сырьевую базу для выработки отечественных препаратов.

В связи с этим большой практический интерес представляют приемы получения фитомассы, основанные на культивировании в искусственных условиях на питательных средах растительных клеток. Обладая рядом преимуществ, этот метод составляет альтернативу природным источникам ценных соединений: 1.Это радикальное решение проблемы дефицита исходного сырья, возможность получения целевого продукта в течение всего года, полная независимость от климата, погоды, почвенных условий, вредителей, а также значительная экономия площадей, занимаемых культивируемыми растениями. 2.Использование вместо интактных растений их клеточных культур значительно расширяет возможности управления процессом биосинтеза целевых продуктов. 3.В результате оптимизации и стандартизации условий культивирования, содержание ценных метаболитов в растительных клетках in vitro и их качественный состав могут превышать таковые в интактных растениях.

Цель работы Целью настоящей работы было исследование регуляции ростовых процессов каллусной культуры Trigonella foenum – graecum, или пажитника греческого. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1.Получение культуры клеток пажитника греческого и исследование эффективности процесса каллусогенеза под влиянием экзогенных ауксинов и цитокининов. 2.Определение ростовых характеристик полученной каллусной культуры. 3.Изучение влияния состава питательной среды на скорость прироста биомассы каллусной культуры пажитника греческого.

Объектом исследований был выбран пажитник греческий - одно из древнейших лекарственных растений, история применения которого насчитывает несколько тысячелетий. Как официальное лекарственное растение оно включено в ряд европейских и других фармакопий. Лекарственным сырьем обычно служат семена, экстракты из которых обладают противовоспалительными, антихолестеринными, тонизирующими, антианемическими, антигельминтными и другими терапевтическими эффектами. В настоящее время препараты, изготовленные из пажитника, с успехом используются при лечении диабета типа ΙΙ или инсулиннезависимого диабета. Семена Trigonella также используют как биологически активную добавку к пище для повышения аппетита. Надземные части пажитника, собранные в конце лета, являются народным средством от спазмов различного происхождения.

Основными биологически активными веществами пажитника греческого являются стероидные сапогенины (в первую очередь, диосгенин), фитостерины, алкалоид тригонеллин, никотиновая кислота, флавоноиды, эфирные масла и др. В настоящее время сапогенины широко используются в фармацевтической промышленности для синтеза гормональных препаратов. Кроме того, у этих соединений была обнаружена способность тормозить рост некоторых форм злокачественных образований; снижать уровень холестерина в крови, а также антигрибная фунгицидная, антибактериальная и антивирусная активности. Наибольшее значение среди стероидных сапогенинов имеет диосгенин. Основными поставщиками сырья для промышленного производства диосгенина является Мексика, страны Центральной Америки, Индия и Китай, где для массовой заготовки используются различные виды диоскореи, паслена и пажитника. В нашей стране отсутствие исходного сырья для медицинской промышленности восполняется за счет импортируемого диосгенина.

Таким образом, изучение условий, способствующих быстрому приросту биомассы культуры клеток пажитника греческого как альтернативного источника многих биологически активных соединений, представляется важной и актуальной задачей.

Методика исследований Для культивирования растительных объектов in vitro была использована основная питательная среда Мурасиге-Скуга с добавлением фитогормонов. Среда содержала: макроэлементы; микроэлементы; источник углерода (сахароза); витамины. Для приготовления твердой среды был использован агар в концентрации 7-8 г/л. Величина pH питательных сред до автоклавирования составляла 5,7-5,8. Для получения каллусов Trigonella foenum – graecum использовались среда Мурасиге-Скуга с 6 комбинациями фитогормонов.

Варианты питательных сред МS (использованные для получения каллусов пажитника греческого) кинетин 2,4-Д 1,0 мг/л1,5 мг/л 0,5 мг/л12 1,0 мг/л34 1,5 мг/л56

Ход работы Первым этапом исследований было получение стерильных растений пажитника греческого. Проводилась многоступенчатая стерилизация семян с последующей посадкой их в стандартную питательную среду. Все манипуляции были проведены с соблюдением правил ассептики в ламинарбоксе. После прорастания семян производили их пересадку в коничесие колбы объемом мл, содержащие безгормональную питательную среду MS, в которых и производилось их дальнейшее выращивание в условиях фитостата.

Для получения каллусов пажитника греческого были использованы листовые и стеблевые экспланты. Все операции осуществлялись с соблюдением правил асептики в ламинарбоксе. Листовые пластинки и стебли разрезали на части длиной 0,5 см и переносили в чашки Петри с питательной средой 6 вариантов, различающихся концентрацией фитогормонов кинетина и 2,4-Д. Чашки герметично заклеивали пищевой пленкой, помещали в термостат и культивировали при температуре 24,6ºС.

Результаты и их обсуждение В результате было установлено, что наиболее эффективное формирование каллусов наблюдается в случае применения следующих сочетаний фитогормонов: вариант 2 – 1 мг/л кинетина + 1 мг/л 2,4- Д; вариант 4 – 1,5 мг/л кинетина + 0,5 мг/л 2,4-Д; вариант 5 – 1,5 мг/л кинетина + 1 мг/л 2,4-Д. В случае использования других вариантов питательных сред степень дедифференциации клеток эксплантов и каллусогенез были менее выражены. Возможно, причиной этого являлось накопление фенольных соединений в травмированных клетках эксплантов, а также несбаллансированность фитогормонального состава питательной среды.

Зависимость ростовых показателей каллусной культуры Silybum marianum от гормонального состава питательной среды Изучение влияния соотношения фитогормонов на ростовые показатели каллусной культуры Trigonella foenum – graecum включало определение следующих параметров: удельной скорости роста и времени удвоения биомассы. Удельная скорость роста: где Wo – начальная масса каллуса, г; Wt – масса каллуса в конце цикла выращивания, г; t – продолжительность культивирования, сут. Время удвоения биомассы: где V – удельная скорость роста. (W t – W 0 ) Δt·W 0 V = In 2 V μ =

Согласно полученным результатам, наиболее высокие значения удельной скорости роста были установлены для каллусов, культивируемых на питательных средах, содержащих 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина, а также 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина. Их величины составляли 0,078 и 0,066 г/сутки соответственно. Наиболее низкие величины удельной скорости роста каллусных культур были характерны для следующих вариантов питательных сред: 1) вариант 6 (1,5 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина); 2) вариант 3 (1,5 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина); 3) вариант 1 (0,5 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина). Они были в среднем в 2,5 раза ниже по сравнению с питательной средой, содержащей 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина, также в 2 раза- по сравнению с питательной средой, включающей 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина.

На следующем этапе была произведена оценка влияния соотношения концентраций ауксинов и цитокининов в питательной среде на время удвоения биомассы каллусной культуры Trigonella foenum – graecum. Из рисунка видно, что минимальное время удвоения биомассы (8,8 суток) было характерно для каллусов, культивируемых на питательной среде, содержащей 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина. Для каллусов, которые выращивались на питательной среде MS, включающей 0,5 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина, данный показатель составлял в среднем 16,5 суток. Для 1, 3 и 4 вариантов питательной среды MS были обнаружены практически равные значения времени удвоения биомассы - от 25 до 26 суток. Наиболее высокий показатель времени удвоения биомассы был характерен для питательной среды MS, содержащей 1,5 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина (вариант 6). В данном случае время удвоения биомассы составляло около 35 суток.среды

Заключение В результате проведенных исследований была получена устойчивая каллусная культура Trigonella foenum – graecum, или пажитника греческого. Показано, что для индукции каллусогенеза у эксплантов пажитника греческого наиболее оптимальной является питательная среда с сочетанием фитогормонов 1,0 мг/л 2,4-Д + 1,0 мг/л кинетина, а наименее – 1,5 мг/л 2,4-Д + 1,5 мг/л кинетина.среда Результаты исследования влияния фитогормонов на показатели роста полученной каллусной культуры пажитника греческого свидетельствуют, что максимальное значение удельной скорости роста (0,078 г сыр.м./сут) и соответственно минимальное время удвоения биомассы (8,8 сут) характерно для питательной среды, содержащей 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0.среды

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ