Молекулярная биология для биоинформатиков Академический университет Ефимова Ольга Алексеевна В презентации выборочно использованы слайды из курса «Мутационный процесс» СПбГУ

Лекция 7 Репарация ДНК Как ДНК сохраняет стабильность? Причины ошибок: Химические агенты Излучение Ошибки репликации Системы репарации в клетке (исправление ошибок в ДНК) Восстановление поврежденной цепи по неповрежденной матрице

Повреждения ДНК приводят к нарушению Уотсон- Криковской структуры, локальной денатурации, блокированию репликации системы репарации Контрольные точки check-points

Сигналы для репарации ДНК: Непосредственно повреждение ДНК События в цитоплазме, например окислительный стресс Репарация поврежденной ДНК – часть общей адаптивной реакции клетки на повреждающие воздействия

Системы репарации –Прямая репарация (фотореактивация) –Эксцизионная репарация Mismatch repair Base excision repair (BER) Nucleotide excision repair (NER) –Пострепликативная (рекомбинационная) репарация –SOS-репарация

Фотореактивация UV-A (320–400 nm) UV-B (290–320 nm) UV-C (100–290 nm) 6

УФ излучение 7

8

Фотореактивация (прямая репарация)

75% 25% Изгиб ДНК 7-9 ° 44° 10 Повреждения ДНК из-за УФ

Где чаще всего возникают фотопродукты? Последовательности ДНК, которые облегчают изгиб и раскручивание ДНК: ssDNA, ТАТАА бокс. Если CPD возник? Влияние на транскрипцию CPD и 6-4PP блокируют РНК- полимеразу II млекопитающих РНК полимераза II остается связанной с точкой препятствия, в результате снижается как уровень РНК полимеразы, так и блокируется транскрипция соответствующего гена. В основном CPD и 6-4PPs блокируют транскрипцию, и только небольшая часть приводит к мутациям. 11

Фотореактивация (1963г) Гены PHR/PRE Кодируют фермент фотолиазу, мономерный флавин- зависимый фермент Кофакторы : FADH- и 5,10-метенилтетрагидрофолат (5,10-MTHF) Связывается в темноте с димерами ТТ На свету кофактор абсорбирует фотон Используя эту энергию фотолиаза расщепляет ТТ димер Фотолиаза освобождает ДНК 12

Фотореактивация 13

Direct repair by photoreactivation. 14

Фотолиазы Принадлежат большому семейству фотолиаз- криптохромов. Представители этого семейства широко распространены во всех царствах В соответствии с их функцией: –CPD-фотолиазы - репарируют CPDs, –(6-4)PP- фотолиазы – репарируют (6-4) фотопродукты – Криптохромы. Не участвуют в репарации ДНК, происходят от фотолиаз. У растений криптохромы регулируют рост, регулируемый синим светом, а у животных – циркадные ритмы. 15

Фотолиазы имеют два типа хромофоров FADH (флавинадениндинуклеотид) и MTHF (метенилтетрагидрофолат). Каталитический кофактор FADH – непосредственно взаимодействует с субстратом – (ТТ димером) в фоторепарирующей реакции. Светоуловитель MTHF– действует как антенна, улавливает энергию и передает ее каталитическому ко-фактору. 16

17 PLAY

Системы репарации –Фотореактивация (прямая репарация) –Эксцизионная репарация Mismatch repair Base excision repair (BER) Nucleotide excision repair (NER) –Пострепликативная (рекомбинационная) репарация –SOS-репарация

Mismatch repair (MMR)

20

Последствия появления ММ 21

If the tautomeric shift is slow, DNA polymerase moves on and a mismatch is incorporated into the DNA 22

Deamination of Cytosine creates a G-U mismatch Easy to tell that U is wrong Deamination of 5-methyl cytosine creates a G-T mismatch Not easy to tell which base is the mutation. В 50% случаев G исправляется на A, что приводит к мутации 23

Пути коррекции ошибочно спаренных оснований (ММ) 1.Коррекция с помощью 3 5 экзонуклеазной активности полимераз 2.Мисмэтч репарация: выявляет некомплементарную пару только на дочерней цепи ДНК и производит замену неправильного основания только на дочерней цепи. 24

Основные белки метил- направляемой MMR в E. coli Mut S и Mut L узнают ММ Mut H - –Узнает полуметилированный сайт GATC и делает надрез MutU (UvrD) – геликаза II раскручивает дуплекс и освобождает надрезанную область 25

A closer look at mismatch repair 26

Mismatch mechanism PLAY

E.coliS.cerevisiaeS.pombeC.elegansD.melanogasterA.ThalianaHuman MutSMSH2 MSH3 MSH6 - MSH2 SWI4 MSH6 - MSH2 - MSH6 - SPEL1 - MSH6 - MSH2 MSH3 MSH6 MSH7 MSH2 MSH3 MSH6 - MutLMLH1 PMS1 MLH2 MLH3 - MLH1 PMS1 - MLH1 PMS1 - MLH1 PMS2 - MLH1 PMS1 - MLH3 - MLH1 PMS2 - MLH3 PMS1 MutH Гомологов у эукариот нет Возникли за счет эндосимбиоти ческих событий - EXO1 - EXO TOSCA - Q9C7N8 AAK EXO1 Гомологи генов MutS, MutL у эукариот 28

MMR у человека PCNA 29

30

Нуклеозид Нуклеотид (монофосфат) Эксцизионная репарация оснований (BER) и нуклеотидов (NER)

основаниенуклеозиднуклеотидНК АденинАденозин (А) Адениловая кислота (АMP) ДНК, РНК ГуанинГуанозин (G) Гуаниловая кислота (GMP) ДНК, РНК ЦитозинЦитидин (С) Цитидиловая кислота (CMP) ДНК, РНК ТиминДезокситимидин (Т) Дезокситимидиловая кислота (TMP) ДНК УрацилУридин (U) Уридиловая кислота (UMP) РНК

Base excision repair

Repairing apurinic and apyrimidinic sites

Nucleotide excision repair

У всех живых организмах NER состоит из следующих этапов: Узнавание повреждений Связывание мультисубъединичного комплекса с поврежденным сайтом Двойное надрезание поврежденной цепи на несколько нуклеотидов от поврежденного сайта в обоих направлениях 5' и 3' Освобождение олигонуклеотида, содержащего повреждение между двумя надрезами Заполнение образовавшейся бреши ДНК полимеразой Лигирование 36

Mechanism of Incision by the NER Pathway E. coli 5 incision is 8 nuc. from lesion 3 incision is 4 nuc. from lesion Mammals 5 incision is 22 nuc. from lesion 3 incision is 6 nuc. from lesion 37 PLAY

Genetics of NER in Humans Xeroderma Pigmentosum (classical) Occurrence: 1-4 per million population Sensitivity: ultraviolet radiation (sunlight) Disorder: multiple skin disorders; malignancies of the skin; neurological and ocular abnormalities Biochemical: defect in early step of NER Genetic: autosomal recessive, seven genes (A-G) Xeroderma Pigmentosum (variant) Occurrence: same as classical Sensitivity: same as classical Disorder: same as classical Biochemical: defect in translesion bypass 38

Xeroderma Pigmentosum 39

Genetics of NER in Humans Cockaynes Syndrome Occurrence: 1 per million population Sensitivity: ultraviolet radiation (sunlight) Disorder: arrested development, mental retardation, dwarfism, deafness, optic atrophy, intracranial calcifications; (no increased risk of cancer) Biochemical: defect in NER Genetic: autosomal recessive, five genes (A, B and XPB, D & G) 40

Cockaynes Syndrome 41

Genetics of NER in Humans Trichothiodystrophy Occurrence: 1-2 per million population Sensitivity: ultraviolet radiation (sunlight) in subset of patients Disorder: sulfur deficient brittle hair, mental and growth retardation, peculiar face with receding chin, ichthyosis; (no increased cancer risk) Biochemical: defect in NER Genetic: autosomal recessive, three genes (TTDA, XPB, XPD) 42

Trichothiodystrophy 43

Системы репарации –Фотореактивация (прямая репарация) –Эксцизионная репарация Mismatch repair Base excision repair (BER) Nucleotide excision repair (NER) –Пострепликативная (рекомбинационная) репарация –SOS-репарация

Пострепликативная (рекомбинационная) репарация

SOS system

Репарация двуцепочечных разрывов