КолебательнаярелаксацияКолебательнаярелаксация Внутренняяконверсия Поглощение Флуоресценция Фосфоресценция Колебательнаярелаксация Интеркомби-национнаяконверсия S0S0S0S0 T1T1T1T1 S1S1S1S1

Переход молекулы в основное состояние с испусканием кванта света называется люминесценцией. В люминесценции различают два вида излучательных переходов: Переход молекулы в основное состояние с испусканием кванта света называется люминесценцией. В люминесценции различают два вида излучательных переходов: флуоресценция разрешенный по спину излучательный переход из возбужденного синглетного состояния S 1 в основное состояние S 0 ; флуоресценция разрешенный по спину излучательный переход из возбужденного синглетного состояния S 1 в основное состояние S 0 ; фосфоресценция запрещенный по спину излучательный переход из возбужденного триплетного состояния Т 1 в основное состояние S 0. фосфоресценция запрещенный по спину излучательный переход из возбужденного триплетного состояния Т 1 в основное состояние S 0. Триплет-синглетные переходы имеют квантово-механический запрет, поэтому среднее время жизни (время жизни возбужденного состояния) молекулы при фосфоресценции составляет порядка с, в отличие от флуоресценции, для которой время жизни возбужденного состояния составляет с. Триплет-синглетные переходы имеют квантово-механический запрет, поэтому среднее время жизни (время жизни возбужденного состояния) молекулы при фосфоресценции составляет порядка с, в отличие от флуоресценции, для которой время жизни возбужденного состояния составляет с. Флуоресцировать способны многие органические вещества, как правило содержащие систему сопряженных π-связей. Наиболее известными являются хинин, POPOP, флуоресцеин, эозин, акридиновые красители, родамины, тиазоловые красители и многие другие. Интерес к этим веществам обусловлен широким спектром их применения: в промышленности, в бихимических, медицинских и химических исследованиях, криминалистике, гидрологии и экологии. Флуоресцировать способны многие органические вещества, как правило содержащие систему сопряженных π-связей. Наиболее известными являются хинин, POPOP, флуоресцеин, эозин, акридиновые красители, родамины, тиазоловые красители и многие другие. Интерес к этим веществам обусловлен широким спектром их применения: в промышленности, в бихимических, медицинских и химических исследованиях, криминалистике, гидрологии и экологии.

монохроматор(возбуждение) источник света кюветнаякамера детектор ЭВМ монохроматор(регистрация) Для регистрации интенсивности флуоресценции используется спектрофлуориметр. Свет от источника (лампы) проходит через монохроматор для выделения определенной длины волны (длина волны возбуждения). Образец находятся в кювете, помещенной в кюветодержатель. Свет, прошедший через образец, также попадает на монохроматор для выделения определенной длины волны (длина волны регистрации). Сигнал регистрируется детектором и далее обрабатывается с помощью ЭВМ.

Величина интенсивности флуоресценции (F) может быть представлена следующим образом: Величина интенсивности флуоресценции (F) может быть представлена следующим образом: I 0 интенсивность падающего светового потока. Определяется особенностями источника света. Следует различать лампы с непрерывным и линейчатым спектром.I 0 –интенсивность падающего светового потока. Определяется особенностями источника света. Следует различать лампы с непрерывным и линейчатым спектром. T=10 -A – доля прошедшего через кювету света (пропускание);T=10 -A – доля прошедшего через кювету света (пропускание); (1-T)=(1-10 -A ) – доля света, поглощенного (1-T)=(1-10 -A ) – доля света, поглощенного веществом; A=εCl – оптическая плотность или поглощение. Определяется концентрацией поглощающего вещества (C), его коэффициентом молярной экстинкции, т.е. способностью поглощать свет, ( ε) и длиной оптического пути (l). q– квантовый выход флуоресценции. Определяется отношением числа излученных квантов к числу поглощенных.q – квантовый выход флуоресценции. Определяется отношением числа излученных квантов к числу поглощенных. k–коэффициент пропорциональности. Определяется особенностями регистрирующей системы ( ширина щелей монохроматора спектрофлуориметра, напряжение на фотоумножителе спектрофлуориметраk–коэффициент пропорциональности. Определяется особенностями регистрирующей системы ( ширина щелей монохроматора спектрофлуориметра, напряжение на фотоумножителе спектрофлуориметра и т.д.). (1)

Согласно уравнению (1), зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации (поглощения) вещества не является линейной и представляет собой кривую с насыщением На рисунке представлена рассчитаннаятеоретически зависимость интенсивности флуоресценции от поглощения для флуоресцентного красителя ATTO-425 с известным квантовым выходом q=0.9 На рисунке представлена рассчитанная теоретически зависимость интенсивности флуоресценции от поглощения для флуоресцентного красителя ATTO-425 с известным квантовым выходом q=0.9

Для линеаризации зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации (поглощения) вещества представим уравнение (1) в следующем виде: Такое представление позволяет нам выделить корректирующий фактор: деление на который позволяет получить линейную зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации (поглощения) вещества:

Введение корректирующего коэффициента W не будет казаться искусственным, если рассмотреть случай двухкомпонентного раствора, в котором оба вещества поглощают свет, но лишь одно флуоресцирует. В этом случае следует ввести множитель, учитывающий долю поглощения флуоресцирующего вещества A fl /A Σ : При этом корректирующий фактор будет определяться только суммарной оптической плотностью раствора, т.е. будет инвариантен относительно вклада оптической плотности флуорофора в суммарную оптическую плотность раствора.

Экспериментально измеренная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации (поглощения) вещества может отличаться от теоретической. Регистрируемая интенсивность флуоресценции может существенно снижаться при увеличении концентрации раствора. На рисунке представлена теоретически рассчитанная (F(A)) и экспериментально измеренная (F exp (A)) зависимость интенсивности флуоресценции от поглощения для флуоресцентного красителя ATTO-425 с известным квантовым выходом q=0.9 F(A) F exp (A)

Различие F(A) и F exp (A) обусловлено особенностями регистрирующей системы. В большинстве современных спектрофлуориметров регистрация флуоресценции происходит не со всей поверхности кюветы, а только из ее центральной При больших концентрациях раствора свет поглощается слоями раствора, прилегающими к передней стенке кюветы,а молекулы в центре кюветы остаются невозбужденными. Регистрирующая система при этом «видит» только центр кюветы, который достигает световой поток, интенсивность которого уменьшается с ростом оптической плотности исследуемого раствора. Именно поэтому регистрируемая интенсивность флуоресценции начинает уменьшаться после достижения некоторой оптической плотности раствора. Различие F(A) и F exp (A) обусловлено особенностями регистрирующей системы. В большинстве современных спектрофлуориметров регистрация флуоресценции происходит не со всей поверхности кюветы, а только из ее центральной части. При больших концентрациях раствора свет поглощается слоями раствора, прилегающими к передней стенке кюветы, а молекулы в центре кюветы остаются невозбужденными. Регистрирующая система при этом «видит» только центр кюветы, который достигает световой поток, интенсивность которого уменьшается с ростом оптической плотности исследуемого раствора. Именно поэтому регистрируемая интенсивность флуоресценции начинает уменьшаться после достижения некоторой оптической плотности раствора. детектор источник детектор источник

Для линеаризации экспериментальной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации вещества можно использовать поправочные коэффициенты, полученные экспериментально. Несмотря на отличие этих коэффициентов от расчетных, они также будут определяться только суммарной оптической плотностью раствора. Для экспериментального определения корректирующих коэффициентов необходимо выбрать эталон, который имеет известный квантовый выход флуоресценции имеет известный квантовый выход флуоресценции имеет спектральные свойства, аналогичные спектральным свойствам исследуемого образца. имеет спектральные свойства, аналогичные спектральным свойствам исследуемого образца. Корректирующие коэффициенты (W exp ) могут быть определены с использованием следующего соотношения: F et, A et, q et - интенсивность флуоресценции, поглощение и квантовый выход флуоресценции эталона, соответственно.

Использование скорректированных значений интенсивности флуоресценции Использование скорректированных значений интенсивности флуоресценции весьма существенно для получения надежных результатов и правильной оценки исследуемых процессов и, в частности, может быть востребовано для: определения квантового выхода флуоресценцентных зондов, связанных с рецепторами, определения неискаженных спектров возбуждения флуоресценции растворов с высокой концентрацией, коррекции Штерн-Фольмеровских зависимостей, построение которых проводится при исследовании процессов тушения (снижения интенсивности) флуоресценции, разделения сложных спектров возбуждения флуоресценции и флуоресценции многокомпонентного раствора на составляющие.