Физико-химические методы исследования биологически активных веществ

Основы хроматографических методов «Никакое другое открытие не оказало на исследования в органической химии такого огромного продолжительного влияния, как анализ с помощью адсорбционной хроматографии Цвета…» П. Каррер, 1947г.

Из истории хроматографии Михаил Семёнович Цвет ( ) День рождения хроматографии – 21 марта 1903г. Доклад М.С. Цвета «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу». Свой метод М.С. Цвет назвал – «хроматография» (запись цвета) Ричард Кун (институт фундаментальной медицины г. Гейдельберг) (1938г. Нобелевская премия по химии за предложенную Цветом адсорбционную хроматографию каратиноидов и витаминов): Альфред Винтерштайн (1915г. Нобелевская премия по химии за исследования хлорофиллов) Арчер Портер Мартин, Ричард Лоуренс Миллингтон Синдж ( 1938г. первый противоточный экстрактор с использованием воды и хлороформа для разделения олигопептидов; 1940г. Использование жидкость-жидкостной хроматографии для разделения аминокислот; 19 ноября 1941г. Статья «Новая форма использования двух жидких фаз для хроматографии» в «Biochemical journal»; 1952г. Нобелевская премия за открытие распределительной хроматографии Арчер Портер Мартин, Энтони Траффорд Джеймс ( 50-е годы первый газовый хроматограф ) Измаилов, Шрайбер (1938г. Первые работы по тонкослойной хроматографии) Шталь (1956г. Использование тонкослойной хроматографии как аналитического метода)

Хроматография – физико-химический метод, основанный на разделении вещества между двумя несмешивающимися фазами Через неподвижную (стационарную) фазу протекает подвижная фаза. Молекулы разделяемых веществ могут находиться в обеих фазах. Эффект разделения основывается на том, что соединения проходят расстояние, на котором происходит разделение, с некоторой, присущей этому соединению, задержкой. Современные хроматографические методы: капиллярная газовая хроматография (КГХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ), высокоэффективная ионная хроматография (ВЭИХ), сверхкритическая флюидная хроматография (ВЭИХ), капиллярный электрофорез (КЭ)

Название методаАнглийская аббревиатура Агрегатное состояниеПроцесс разделения Техника проведения разделения подвижной фазы стационарной фазы Жидкость-жидкостная хроматография LLCжидкое распределениеLC (ЖХ), HPLC (ВЭЖХ), TLC (ТСХ), PC (бумажн. хромат.) Газожидкостная хроматография GLCгазообразноежидкоераспределениеGC (ГХ) Жидкостная хроматография LCжидкоетвердоеадсорбцияLC (ЖХ), HPLC (ВЭЖХ), PC (бумажн. хромат.) Газовая хроматография GCгазообразноетвердоеадсорбцияGC (ГХ) Классификация хроматографических методов по агрегатному состоянию фаз, типам процессов разделения и техникам проведения

Название методаАнглийская аббревиатура Агрегатное состояниеПроцесс разделения Техника проведения разделения подвижной фазы стационарной фазы Жидкостная хроматография LCжидкоетвердоеадсорбцияLC (ЖХ), HPLC (ВЭЖХ), PC (бумажн. хромат.) Газовая хроматография GCгазообразноетвердоеадсорбцияGC (ГХ) Адсорбция – концентрирование вещества твердой фазой; Твердая фаза – адсорбент; Хроматографическая колонка - кассета с адсорбентом, в данном случае адсорбент – неподвижная фаза; Подвижная фаза – жидкость (жидкостная хроматография) или инертный газ (газовая хроматография); Аналиты – соединения, выделенные в результате хроматографирования

Жидкостная хроматография низкого давления (low pressure liguid chromatography, LPLC) используется в основном для выделения чистых веществ (препаративная хроматография) Основные понятия: Подвижная фаза (элюент) – растворитель (смесь растворителей), пропущенный через колонку; Элюирование – пропускание элюента через хроматографическую колонку; Элюат – фильтрат, вытекающий из хроматографической колонки; Элюент Хроматографическая колонка Силикагель (µ 100 микрометров, т.е. 0.1 мм) Элюат Недостаток LPLC – низкая разрешающая способность (хроматографические зоны компонентов широкие)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) high performance liguid chromatography HPLC ( жидкостная хроматография высокого давления) Используется для аналитических целей Колонка ВЭЖХ (l ~ см; Ø мм; µ 3-5 микрометров) 1- емкость для забора элюента 2 – насос 3 - инжектор 4 - колонка для ВЭЖХ 5 – термостат 6 – детектор 7 - регистрирующая система Блок-схема жидкостного хроматографа

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Пик – зависимость концентрации вещества в элюате от времени элюирования. Площадь пика пропорциональна концентрации вещества в пробе. Удерживание вещества в колонке – характеристика вещества в данной хроматографической системе t Rx – Время удерживания (время, за которое анализируемое вещество доходит от места ввода пробы до детектора; V R - Объем удерживания (произведение времени удерживания на объемную скорость подачи подвижной фазы) t Rx – Приведенное время удерживания (t Rx - t 0 ) k – Фактор удерживания (t Rx / t 0 ) t 0 – Мертвое время колонки (время, необходимое подвижной фазе чтобы пройти по колонке от места подачи пробы к детектору; Хроматограмма (графическое представление результата разделения) – зависимость сигнала детектора от времени элюирования

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Разрешение (R)– степень разделения двух веществ R = 2 x (t Rx – t Ry ) / (w X + w Y ) wRwR w R – ширина пика R у основания R = 0 (вещества не разделяются) R = 1 (перекрывание ~ 2% площадей двух пиков) R 1 (пики разделяются до базовой линии) Факторы, влияющие на разрешение: удерживание, селективность, эффективность

Селективность – способность хроматографической системы к разделению веществ α = k Rx / k Ry α = 1 (полное отсутствие селективности, т.е. разделение не происходит ) Разделение на данном адсорбенте при применении данного элюента принципиально возможно при α > 1 ! При постоянной селективности хроматограмма выглядит одинаково(последовательность элюирования, пропорции между факторами удерживания постоянны) Для изменения селективности меняют либо адсорбент, либо состав эюента Разделение с различной α Разделение с одинаковой α

Эффективность хроматографической колонки – величина размывания хроматографической зоны Эффективность (N) – свойство хроматографической колонки, определяется: размером частиц адсорбента (µ) качеством изготовления адсорбента; качеством упаковки колонки адсорбента w 1/2 ширина пика на половине высоте N = x (t Rx / w 1/2 ) 2 Определение эффективности колонки (тестирование колонки) проводят при: скорости подвижной фазы 1мл/мин (Ø 4.6 мм), определенным адсорбатам 9толуол, нафталин) Пиковая плотность (n) – число пиков, которые могут быть расположены на хроматограмме друг за другом с разрешением, равным единице n = x N x lg (1 + k) N – эффективность K – фактор удерживания последнего компонента

Основная формула хроматографии R = 1/4 x (α – 1) / α x N x k RY / (k RY + 1) R - разрешение α - селективность N – эффективность k RY – фактор удерживания второго пика Разделение при увеличении k (время анализа сильно возрастает!) Разделение при увеличении N Разделение при улучшении α Как улучшить разрешение?

Как управлять временем удерживания? Принцип «Подержать и отпустить»: в хроматографии все должно смываться, но постепенно

100 H 2 O 54 CH 3 OH 47 CH 3 CN 37 ИПС 32 CH 3 -CO-CH 3 23 CH 2 Cl 2 21 THF 1 C 6 H 14 Ряд полярности растворителей, применяемых в ЖХ Октадецил-силикагель (С18 фаза) Цианопропил-силикагель (Нитрильная фаза) Аминопропил-силикагель (Аминофаза) Силикагель Адсорбенты, применяемые в ЖХ

ЖХ: Удерживание = Взаимодействие «А-А» - Взаимодействие «А-Э» Взаимодействие «Адсорбат-Элюент» Как происходит удерживание Нормально-фазовая (НФ, normal phase, NP) – хроматографическая система, основанная на полярном адсорбенте Обращенно-фазовая (ОФ, reversed-phase, RP) – хроматографическая система, основанная на неполярном адсорбенте Взаимодействие «Адсорбат-Адсорбент»

Обращенная фаза (неполярный адсорбент) Основа – основной компонент элюента (растворитель) Добавка – дополнительный компонент элюента В ОФ хроматографии основа – всегда более полярный растворитель, чем добавка (т.е., основа – полярная, добавка - неполярная) Чем больше в элюенте доля неполярной добавки – тем меньше удерживание! Для ОФ ВЭЖХ: Адсорбент - С18 силикагель; Основа элюента – Н 2 О или водно-солевой буфер Добавка – ацетонитрил, метанол, реже ТГФ или ИПС 100 H 2 O 54 CH 3 OH 47 CH 3 CN 37 ИПС 23 CH 2 Cl 2 21 THF 1 C 6 H 14 Увеличение элюирующей силы в ОФ ВЭЖХ Неполярный адсорбент Адсорбат Полярная основа Неполярная добавка

Нормально-фазовая система 100 H 2 O 54 CH 3 OH 47 CH 3 CN 37 ИПС 32 CH 3 -CO-CH 3 23 CH 2 Cl 2 21 THF 1 C 6 H 14 Увеличение элюирующей силы растворителя в НФ Для НФ ВЭЖХ: Основа – гексан Полярная добавка – диоксан, ТГФ, EtOAc, CHCl 3, CH 2 Cl 2, ацетон, ИПС Модификаторы: H 2 O, AcOH, ТЭА Модификатор – растворитель, способный модифицировать поверхность адсорбента. Подавляет влияние остаточной влаги (стабилизирует удерживание) Полярный адсорбент Адсорбат Модификатор

Нормально-фазовая гидрофильная хроматографическая система (HILIC, hydrophilic interaction chromatography) Гидрофильная хроматография – НФ ВЫЖХ, но с более полярным элюентом. Применяется для разделения сильнополярных веществ. Для HILIC: Основа – ацетонитрил Полярная добавка и модификатор – вода или водно-солевой буфер Чем больше в элюенте воды – тем меньше удерживание Уравнение Скотта 1/V R = A + B x C доб. V R – удерживаемый объем С доб. – доля добавки в элюенте А, B - коэффициенты Вид зависимости удерживания от концентрации добавки в элюенте

Удерживание ионных соединений на обращенной фазе/ Органические кислоты. При pH = pKa [молекулярная форма] = [ионная форма] В ОФ ВЭЖХ аналиты предпочтительно переводить в молекулярную форму. pH = 2.5 достаточно для ОФ хроматографирования большинства органических кислот (используют H 3 PO 4 ) Равновесие форм бензойной кислоты в водном растворе при различных pH. Вид хроматограммы бензойной кислоты в зависимости от pH водной основы элюента

Удерживание ионных соединений на обращенной фазе. Органические основания Органические основания в ОФ ВЭЖХ разделяются в виде ионных форм Содержание модификатора (ТЭА) в элюенте (1-2%) Схема действия модификатора: А) без модификатора Б) с модификатором 1 – неионное соединение 2 – основное ионное соединение

Удерживание ионных соединений на обращенной фазе. Смесь нейтральных соединений, органических кислот и оснований Уникальная ОФ система: элюент органический растворитель (1% водный р-р ТЭА, pH 2,5 фосфорной кислотой) 1,2 – органические кислоты 4,5 - органические основания 3 - неионное соединение Изменение ОФ хроматограммы смеси нейтральных и ионных соединений в зависимости от состава водной основы

Объект анализаЭлюент Фруктовые орг. кислоты (щавелевая, винная, аскорбиновая, молочная, уксусная, лимонная) 25 мМ (миллимоль/литр) водн. р-р KH 2 PO 4, pH 2 фосфорной кислотой Водорастворимые витамины (аскорбиновая кислота, никотиновя кислота, никотинамид, пиридоксин, кофеин, тиамин, биотин, рибофлавин) Ацетонитрил-(10 мМ водн. р-р гептилсульфоната Na с 1% ТЭА, pH 2.5 фосфорной кислотой) 10:90 Природные алкалоиды (скополамин, атропин, бруцин) Ацетонитрил-(вода, pH 2.5 фосфорной кислотой) 20:80 Фармпрепараты (парацетамол, кофеин, салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота), консерванты и подсластители (сахарин, аспартам, бензойная кислота, сорбиновая кислота) Ацетонитрил-(1% водн. р-р ТЭА, pH 2.5 фосфорной кислотой) 20:80 Пиридины и аналиныАцетонитрил-(1% водн. р-р ТЭА, pH 3.5 фосфорной кислотой) 50:50 Фармпрепараты (трициклические антидепрессанты) Ацетонитрил-(1% водн. р-р ТЭА, pH 3.5 фосфорной кислотой) 60:40 Наиболее распространенные ОФ элюенты, применяемые с С18 силикагелем

ЖХ: Удерживание = Взаимодействие «А-А» - Взаимодействие «А-Э» Взаимодействие «Адсорбат-Элюент» Взаимодействие «Адсорбат-Адсорбент» ГХ: Удерживание = Взаимодействие «А-А» Взаимодействие «Адсорбат-Адсорбент» Принцип «Подержать и отпустить»