Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики Кириллова Мария Александровна Руководитель: к.б.н. Есимбекова Е. Н. Красноярск 2012

Микробная загрязненность - показатель санитарного качества продуктов питания, воды, чистоты поверхностей Методы определения микробного загрязнения: 1.Микробиологические 2.Биолюминесцентный метод, основанный на измерении АТP 3.Биолюминесцентный метод, основанный на измерении FMN 2

Цель Разработать метод анализа микробного загрязнения с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий, основанный на определении количества FMN в образце. 3

Материалы и методы Реакционная смесь 0,05 М фосфатный буфер комплекс ферментов люцифераза - оксидоредуктаза 0,0025% тетрадеканаль 5*10 -5 ÷10 -3 М NADH 5*10 -8 ÷10 -6 М FMN Исследуемый объект Escherichia Coli (BL21 codon Plus (DE3) RIPL), выращенные в лаборатории Фотобиологии ИБФ СО РАН на среде LB без антибиотиков в течение 18 часов при 30ºС. Образцы бактерий исследовали в стационарной фазе роста. Оптическая плотность при λ=590 нм D=6,4; 1 ед.опт.пл.=5*10 8 клеток/мл 4 Люминометр Lumat LB9507 h NADH:FMN-oxidoreductase (R) NAD(P)H + H + + FMN NAD(P) + + FMNH 2 Luciferase (L) FMNH 2 + RCHO + O 2 FMN + RCOOH + H 2 О + h Колонии E. coli

Калибровочная кривая для определения FMN Максимальная чувствительность биферментной системы 1,2*10 -9 М FMN 5

Анализируемые образцы Escherichia Coli (штамм BL21) Образец 1. Интактные клетки Образец 2. Клетки, разрушенные ультразвуковым дезинтегратором при частоте 44 кГц Образец 3. Надосадочная жидкость после центрифугирования разрушенных клеток (5000 об/сек, 12 мин) 6

Зависимость интенсивности свечения от количества бактериальных клеток (образец 2) Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы составляет 3,9 млн. бактериальных клеток 7

Зависимость интенсивности свечения от количества бактериальных клеток (образец 3) Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы составляет 5 млн. бактериальных клеток 8

Сравнение с АТР-системой Система светлячков Предел обнаружения АТР – М. Предел обнаружения бактериальных клеток – 1000 кл / мл Бактериальная система Предел обнаружения ФМН -1,2 ·10 -9 М Предел обнаружения бактериальных клеток – 3,9 млн. кл /мл 9

Санитарные правила и нормы Группа продуктов Количество бактерий, КОЕ/г не более Вода минеральная100 Молоко3*10 5 Мясо10 3 Рыба свежая5*10 4 Овощи10 4 – 5*10 5 Пиво500 Мороженное10 5 Масло сливочное

Выводы Для анализа бактериальной загрязненности образец достаточно подвергнуть разрушению ультразвуковым дезинтегратором Предел обнаружения бактериальных клеток – 3,9 млн. кл /мл Чувствительность метода ниже чувствительности АТР-системы на 3 порядка 11

Перспективы Возможна разработка биолюминесцентного метода анализа бактериальной загрязненности, основанного на измерении NADH Предварительно полученные результаты указывают на высокую чувствительность биолюминесцентного метода к NADH (до 1· М), что сравнимо с чувствительностью люциферазы светляков к АТФ В дальнейшем планируется для упрощения процедуры проведения анализа разработка иммобилизованного ферментного препарата 12