Гиндуллина Т.М.

Колоночная хроматография 2 (объема)

Хроматографические параметры Выходная кривая (кривая элюирования) – зависимость концентрации компонента от времени хроматографирования (объема элюата) Время удерживания - время от момента ввода пробы до регистрации максимума пика (отрезок OG на графике) Время удерживания складывается из времени пребывания вещества в подвижной и неподвижной фазах Первое фактически равно времени прохождения через колонку несорбируемого компонента (отрезок ОО / на графике) 3 (t)

Время удерживания не зависит от количества пробы зависит от: природы вещества и сорбента скорости потока газа-носителя упаковки сорбента и может меняться от колонки к колонке исправленное время удерживания 4

Удерживаемый объем – объем газа-носителя, который должен быть пропущен от момента ввода пробы до появления максимума пика на хроматограмме F – объемная скорость потока, мл/с Объем для вымывания несорбируемого компонента V o включает в себя объем колонки, не занятый сорбентом Приведенный удерживаемый объем 5

При постоянных условиях хроматографирования: скорость потока давление температура состав фаз значения характеристик удерживания строго воспроизводимы и могут быть использованы для идентификации компонентов в качественном анализе и для физико-химических исследований 6

Теория теоретических тарелок Общая теория для многостадийных процессов (дистилляция, противоточная экстракция) Мартин и Синдж применили ее к хроматографии 7

Допущения теории т.т. Хроматографическая колонка – ряд последовательных горизонтальных слоев – теоретических тарелок (т.т.) Равновесие на каждой тарелке между ПФ и НФ устанавливается мгновенно Количество вводимой пробы мало, а изотерма сорбции линейна Все процессы в колонке взаимонезависимы 8

Каждая порция ПФ смещает равновесие и переносит часть вещества на следующую тарелку, где вновь устанавливается равновесие Происходит ступенчатый переход вещества с тарелки на тарелку (сорбция - десорбция, растворение - испарение) Вещество распределяется на нескольких тарелках, на средней – его концентрация максимальна 9

Зона компонента имеет форму и ширину нормального распределения Гаусса: Х и Хо – расстояние от начала тарелки до места с концентрацией С и Сmax H – высота, эквивалентная теоретической тарелке, ВЭТТ ( высота слоя сорбента, на которой достигается равновесие), см L – длина колонки, в которой размещено N т.т., см 10

N – число т.т. N = L/H Чем > N, тем большее число раз устанавливается равновесие между ПФ и НФ, тем эффективнее колонка Для хорошей колонки N~n.1000, H~0,3-1 мм w 1/2 –ширина полупика, выраженная в единицах времени (мин) или объема (мл) 11

Недостатки теории тарелок Процесс сорбции рассматривается как ступенчатый, тогда как он непрерывный Не учитываются свойства сорбента, природа сорбата, скорость потока ПФ, кинетика массопереноса Не объясняется размывание хроматографического пика, не дается рекомендаций, как этого избежать 12

Кинетическая теория Предложили Ван Деемтер и Клинкенбург Н – высота, эквивалентная теоретической тарелке, см v – линейная скорость прохождения газа-носителя через колонку, см/с А, В, С – константы размывание хроматографической полосы связано с тремя основными факторами: 13

1. Вихревая диффузия (слагаемое А) Хроматографическая колонка заполняется твердым зерненым сорбентом, поэтому ПФ перемещается по колонке через множество взаимосвязанных каналов Одни молекулы могут продвигаться более короткими путями, другие – более длинными. Время пребывания последних молекул в колонке соответственно возрастает, что приводит к размыванию хроматографического пика Вихревая диффузия зависит от размеров частиц (d) и плотности заполнения колонки (λ), не зависит от скорости ПФ А = 2λd, в идеале Н эф = d, на практике H = (3-5)d 14

2. Молекулярная диффузия Слагаемое В/v характеризует размывание пиков, вызываемое диффузией анализируемого вещества в газе-носителе (диффузия в жидкой фазе ничтожно мала) При бесконечно малой скорости газа-носителя вещество перемещается вниз по колонке под действием собственной молекулярной диффузии Величина В/v, а следовательно, и Н в этом случае бесконечно большие 15

3. Сопротивление массопередаче Слагаемое Сv характеризует скорость распределения вещества между газом-носителем и неподвижной жидкой фазой Чем меньше толщина слоя жидкости на твердом носителе и чем меньше вязкость этой жидкости, тем быстрее устанавливается равновесие 16

График уравнения Ван-Деемтера ( ГХ ) Для малых скоростей потока заметнее вклад B/v, для больших – вклад Cv 17

18

Колонка эффективна, если: Частицы сорбента невелики Упаковка плотная Вязкость НФ мала Толщина пленки НФ мала Скорость ПФ оптимальна А, В, С можно подобрать на практике Зависимость ВЭТТ от скорости ПФ в ЖХ Слагаемое B/v роли не играет, т.к. коэффициенты диффузии в жидкости на 3-4 порядка меньше, чем в газах 19

Качественный анализ 1. Идентификация по параметрам удерживания Сравнивают и сопоставляют время удерживания и удерживаемый объем для определяемых и стандартных веществ; хроматографирование проводится в идентичных условиях Совпадение параметров удерживания служит основанием для идентификации Иногда пользуются табличными данными 20

2. Использование относительных параметров удерживания Для идентификации надежнее использование относительных параметров удерживания, т.к. они зависят только от состава ПФ и НФ 21

3. Закономерность изменения параметров удерживания в гомологическом ряду, например: Т – температура кипения a и b - зависят от функциональной группы гомологов и условий анализа Если известны Т кип членов ряда, можно определить удерживаемый объем 22

4. Нехроматографические методы идентификации В элюате можно определять вещества другими методами исследования: ИК-спектроскопия масс-спектрометрия метод ядерного магнитного резонанса пламенная фотометрия и др. 23

Индексы удерживания Ковача Индексы удерживания Ковача отражают хромато- графические характеристики веществ в единой шкале, определяемой серией однотипных стандартов, в качестве которых используются н-алканы Если в качестве нулевого алкана принять водород (С 0 Н 2*0+2 ) и принять его индекс удерживания за 0, то в данной системе можно представить практически все вещества 24

Индексы удерживания веществ рассчитывают по формуле: Здесь R x, R N и R N+n - приведенные величины удерживания (объемы, времена или расстояния на хроматограммах) исследуемого вещества и алканов с N и N + n углеродными атомами Индекс удерживания любого н-алкана равен числу его углеродных атомов, умноженному на 100: этана - 200, бутана – 400 и т. д. Если индекс удерживания какого-либо вещества равен 930, то это вещество будет выходить из колонки после н-нонана 25

Количественный анализ Используется зависимость площади (высоты ) пика от концентрации компонента S = f(C) Площадь пика: h – высота пика, мм - ширина пика на 1/2 его высоты 26

Метод абсолютной градуировки (внешнего стандарта) экспериментально определяют зависимость высоты или площади пика от концентрации вещества и строят градуировочный график определяют те же параметры пиков в анализируемой смеси и по градуировочному графику находят концентрацию анализируемого вещества это основной метод определения микропримесей метод не требует разделения всех компонентов смеси, а ограничивается лишь теми, определение которых необходимо в данном конкретном случае 27

28

Метод внутреннего стандарта в анализируемую смесь вводят точно известное количество стандартного вещества, близкого по физико-химическим свойствам к компонентам смеси Это вещество должно отсутствовать в исследуемой смеси и давать на хроматограмме пик, отдельный от других компонентов После хроматографирования измеряют площади пиков анализируемого компонента (S i ) и стандартного вещества (S CT ) 29

Массовую долю компонента (W i, %) рассчитывают по формуле: r – отношение массы внутреннего стандарта к массе пробы 30

Метод простой нормировки Сумму площадей пиков всех компонентов принимают за 100 % Метод чаще всего используют на практике Для его использования необходимо, чтобы вещества были химически сходны 31

Метод нормировки с поправочными коэффициентами Метод используют, если чувствительность детектора различна по отношению к разделяемым компонентам смеси Метод применим, при полном разделении пиков и полной идентификации компонентов Используется для малого числа компонентов смеси 32

Газовая хроматография ГХ – это вариант хроматографии, в котором подвижной фазой является инертный газ (газ- носитель), протекающий через неподвижную фазу, обладающую большой поверхностью ПФ: гелий, азот, аргон, водород, диоксид углерода или воздух Требования к газу-носителю: инертность по отношению к разделяемым веществам и сорбенту взрывобезопасность чистота 33

Газовая хроматография – метод разделения летучих соединений Можно анализировать газообразные, жидкие и твердые вещества, отвечающие требованиям: молекулярная масса меньше 400 летучесть инертность легкость получения термостабильность Это, как правило, органические вещества, хотя методом ГХ можно определять и почти все элементы периодической системы в виде летучих соединений 34

Газотвердофазная хроматография (ГАХ) НФ в ГАХ – искусственные и природные адсорбенты – активированные угли, силикагели, оксид алюминия пористые стекла, пористые полимеры, синтетические цеолиты (молекулярные сита), макропористые силикагели (силохром, порасил, сферосил) Требования к адсорбентам: Селективность отсутствие каталитической активности химическая инертность к компонентам разделяемой смеси механическая прочность высокая удельная поверхность (10–1000 м 2 /г) 35

Области применения ГАХ анализ смесей газов и низкокипящих углеводородов, не содержащих активных функциональных групп определение воды в неорганических и органических материалах примеры: разделение О 2, N 2, СО, СН 4, СО 2 на глинистых материалах разделение гидридов металлов (Ge, As, Sn, Sb) на сорбентах порапаках 36

Газожидкостная хроматография НФ в ГЖХ - практически нелетучая при температуре колонки жидкость, нанесенная на твердый носитель Требования к жидкой фазе: 1) способность хорошо растворять компоненты смеси 2) инертность по отношению к компонентам смеси и твердому носителю 3) малая летучесть 4) термическая устойчивость 5) достаточно высокая селективность 6) небольшая вязкость 7)способность образовывать прочно связанную с носителем равномерную пленку 37

Природа жидкой фазы является тем основным фактором, который определяет последовательность выхода компонентов из колонки В качестве жидких фаз применяются неполярные парафины (сквалан, апиезоны, вазелиновое масло) умеренно полярные ( сложные эфиры, нитрилы и др.) полярные (полиэтиленгликоли или карбоваксы, гидроксиламины и др.) 38

Твердым носителем обычно служит практически инертное твердое вещество, на которое наносят неподвижную жидкость Требования к твердому носителю: способность удерживать жидкую фазу на своей поверхности в виде однородной пленки значительная удельная поверхность (0,5-10 м 2 /г) макропористость, однородность пор по размерам отсутствие каталитической активности механическая прочность стабильность при повышенных температурах однородность размера зерен Однако до настоящего времени не создано универсального носителя, удовлетворяющего всем перечисленным требованиям 39

В качестве твердых носителей в газо-жидкостной хроматографии используются диатомиты (кизельгур, инфузорная земля) синтетические кремнеземы (макропористые силикагели, широкопористые стекла, аэросилогели) полимерные носители на основе политетрафторэтилена и т.д. 40

Газовый хроматограф (блок-схема ) 1 – баллон со сжатым газом; 2 – дозатор для ввода пробы; 3 – хроматографическая колонка; 4– термостат; 5 – детектор; 6– процессор; 7– самописец (монитор) 41

Газ-носитель из баллона (1) пропускают под давлением через хроматографическую систему Пробу вводят в дозатор(2) в испарителе, температура которого много выше Т кип компонентов смеси ПФ переносит пары смеси в колонку (3), компоненты смеси распределяются на колонке в соответствии с сорбируемостью (растворимостью) Количество вещества на выходе из колонки обнаруживают с помощью детектора (5) Самописец или компьютер регистрирует сигнал в виде хроматограммы (7) 42

43

Пробу перед вводом в колонку дозируют – впрыскивают с помощью микрошприца ( V=0,5- 20 мкл) в поток ПФ через силиконовую мембрану Проба мгновенно испаряется, т.к. температура дозатора выше температуры колонки на 50 44

Колонки Насадочные Диаметр около 2-5 мм Длина 0,5 – 20 м изготавливают из нержавеющей стали, меди, латуни, стекла Материал колонок должен обладать химической инертностью по отношению к компонентам пробы распространены спиральные, U- и W - образные колонки Капиллярные Диаметр около 0,2-0,5 мм Длина 10 – 100 м изготавливают из кварцевого стекла В ГАХ толщина слоя сорбента составляет 5-10 мкм В ГЖХ жидкость (НФ ) наносят на внутреннюю стенку колонки слоем 0, мкм 45

Колонки в газо-жидкостной хроматографии Набивная колонка

Детектор Это устройство для обнаружения изменений в составе газа, прошедшего через колонку Показания детектора преобразуются в электрический сигнал, который регистрируется самопишущим прибором на бумаге или дисплее компьютера 48

Типы детекторов 1. Катарометр (детектор по теплопроводности) измеряется сопротивление нагретой вольфрамовой нити, омываемой газом-носителем. При изменении состава газовой смеси меняется теплопроводность газа и сопротивление нити Чувствительность катарометра тем выше, чем больше теплопроводность газа-носителя Наиболее подходящим газом-носителем является водород, в целях техники безопасности чаще применяется гелий Достоинства катарометра: простота, достаточная точность и надежность в работе Однако из-за невысокой чувствительности он не применяется для определения микропримесей 49

1 - ввод газа из хроматографической колонки; 2 - вывод продуктов в атмосферу; 3 - нить сопротивления; 4 - изолятор; 5 - металлический блок катарометра 50

2. Детектор электронного захвата Газ-носитель (гелий, азот) ионизируют потоком радиоактивных частиц, концентрацию свободных электронов измеряют с помощью пары электродов В присутствии вещества, захватывающего свободные электроны, ток уменьшается детектор дает ток на соединения, содержащие галогены, серу, фосфор, нитраты, свинец, кислород Не реагирует на большинство углеводородов 51

Схема детектора электронного захвата 1 – ввод газа 2 – источник излучения 3 – вывод в атмосферу 4, 5 - электроды 52

3. Пламенно-ионизационный детектор измеряют электрическую проводимость пламени водородной горелки При появлении в пламени водорода примесей органических соединений происходит ионизация пламени, пропорциональная концентрации примеси, ток резко усиливается Детектор применим только для анализа органических веществ Не реагирует на аммиак, сероводород, воду, кислород, азот, оксид серы, оксид углерода, водород, инертные газы Имеет широкую область линейного отклика (6-7 порядков), поэтому наиболее пригоден для определения следов 53

Схема ПИД 1 – ввод водорода 2 – ввод газа из колонки 3 – ввод воздуха 4 – катод 5 – пламя 6 – собирающий электрод 7 - вывод в атмосферу 54

Области применения ГХ ГХ – один из самых современных методов многокомпонентного анализа Достоинства метода: экспрессность, высокая точность, чувствительность, автоматизация Эффективен при разделении и определении веществ одного класса – углеводороды, спирты, органические кислоты и др. Методом ГХ анализируют продукцию основной химии и промышленности основного органического синтеза Метод незаменим в нефтехимии для определения состава бензинов, керосинов, масел ГХ используется в биологии, медицине, в технологии переработки древесины, в лесохимии и пищевой промышленности – - для определения лекарственных веществ, пестицидов, витаминов, наркотиков и др. Метод используется в препаративных целях, для очистки химических препаратов 55

Газовая хроматограмма смеси веществ

Жидкостная хроматография В методе ЖХ подвижной фазой служит жидкость Метод ЖХ применим для разделения более широкого круга веществ, чем метод ГХ, поскольку большинство веществ не обладает летучестью, а многие из них неустойчивы при высоких температурах В ЖХ разделение чаще всего происходит при комнатной температуре Жидкая ПФ, в отличие от газа в ГХ, не только выполняет транспортную функцию, но и является активным элюентом. Молекулы жидкой фазы могут сорбироваться на поверхности неподвижной фазы Поэтому при прохождении через колонку компоненты смеси должны вытеснить молекулы элюента с поверхности сорбента Применяя различные элюенты, можно изменять параметры удерживания и селективность хроматографической системы 57

В классическом варианте ЖХ используют стеклянные колонки длиной 1–2 м, размер частиц сорбента ~100 мкм ПФ движется под действием силы тяжести, поэтому анализ продолжителен. Однако такой вариант ЖХ не требует дорогостоящего оборудования и до сих пор находит применение В высокоэффективном варианте метода – ВЭЖХ - используют сорбенты с меньшим размером частиц (до 5–10 мкм), нагнетательные насосы для увеличения скорости ПФ, чувствительные детекторы Достоинства метода ВЭЖХ: универсальность, возможность разделения и анализа сложных смесей органических и неорганических веществ, экспрессность, эффективность и высокую чувствительность Это серийный метод определения органических соединений многих классов, его широко используют при анализе смесей аминокислот, белков, лекарственных препаратов ВЭЖХ находит применение и в неорганическом анализе для разделения ионов в зависимости от их размера 58

Метод ВЭЖХ основан на разделении анализируемого экстракта в неподвижной фазе хроматографической колонки (рисунок 1) и дальнейшей их идентификации и количественном определении с помощью специальных детекторов 59

Адсорбционная хроматография В зависимости от полярности неподвижной и подвижной фаз различают нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографии В НФХ используют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы В ОФХ – неполярный адсорбент и полярные подвижные фазы Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые компоненты Подвижная фаза, т.е.растворитель, должна обеспечить различную емкость колонки и эффективное разделение за приемлемое время 60

Неподвижные фазы - тонкодисперсные пористые материалы с удельной поверхностью более 50 м 2 /г Полярные адсорбенты (SiO 2, Al 2 O 3, оксиды металлов, флорисил и др.) имеют на поверхности слабокислотные ОН-группы, способные удерживать вещества с основными свойствами Недостаток полярных сорбентов – высокая чувствительность к содержанию воды в растворителях, приводящая к изменению свойств поверхности и невоспроизводимым результатам анализа Для ВЭЖХ применяют полярные сорбенты с привитыми полярными группами (амины, диолы и др.), что позволяет менять селективность, подбирая подходящий элюент 61

Неполярные адсорбенты (графитированная сажа, кизельгур, диатомит) не проявляют селективности к полярным молекулам Используют также сорбенты с привитыми неполярными фазами, например силикагель с алкилсилильными группами от С 2 до С 22 Кроме того, используют поверхностно-пористые носители – стеклянные шарики, покрытые тонким пористым слоем активного полярного или неполярного сорбента Такие сорбенты оказывают малое сопротивление потоку, за счет чего увеличивается скорость анализа 62

Подвижные фазы ПФ должна растворять анализируемую пробу, обладать малой вязкостью; должна быть возможность выделения из нее разделенных компонентов Подвижная фаза должна быть инертной по отношению к материалам всех частей хроматографа, безопасной, дешевой В ЖХ важен выбор подвижной фазы, поскольку она оказывает большое влияние на селективность разделения, эффективность колонки и скорость движения хроматографической полосы 63

Разделения компонентов достигают, меняя элюирующую силу растворителя Элюирующая сила определяется полярностью растворителя В НФХ с увеличением полярности растворителя элюирующая сила растворителя растет, в ОФХ – снижается Часто применяют не индивидуальные растворители, а их смеси. Незначительные добавки другого растворителя, особенно воды, существенно увеличивают элюирующую силу элюента При разделении многокомпонентных смесей часто применяют метод ступенчатого или градиентного элюирования, применяя в процессе хроматографирования последовательно все более сильные элюенты Это позволяет элюировать сильноудерживаемые вещества за меньшее время 64

Для разделения веществ разной полярности и для разделения соединений разных классов применяют НФХ из неполярных ПФ соединения разных классов выходят из колонки с полярным сорбентом за разное время( соединений увеличивается с ростом их полярности) Для очень полярных веществ так велики, что элюировать их неполярными элюентами невозможно, используют полярные элюенты В ОФХ неподвижная фаза сильнее адсорбирует неполярные компоненты из полярных элюентов, например из воды Снижая полярность элюента, можно уменьшить компонентов Метод адсорбционной ВЭЖХ – это серийный метод определения органических соединений многих классов, его широко используют при анализе смесей аминокислот, белков, лекарственных, препаратов 65

Распределительная хроматография В этом методе вещества распределяются между двумя несмешивающимися жидкостями Жидкую НФ наносят на пористый инертный сорбент и заполняют им распределительную колонку При пропускании жидкой подвижной фазы через колонку смесь разделяется на компоненты главным образом за счет их различной растворимости в жидкой неподвижной фазе Обычно растворимость компонентов пробы в подвижной и неподвижной фазах, обладающих разной полярностью, сильно различается 66

Если растворимость пробы выше в НФ, то время удерживания компонентов значительно возрастает. Если растворимость пробы выше в ПФ, то время удерживания может быть близким к времени удерживания несорбируемого компонента Чтобы добиться разделения, в подвижную фазу, насыщенную неподвижной, включают третий компонент, снижающий различие в полярности подвижной и неподвижной фаз. Например, к смеси из неполярного (гексан) и полярного (вода) растворителей прибавляется спирт 67

В нормально-фазовой распределительной хроматографии используют следующие системы: полярный растворитель (вода, спирт) фиксирован на твердом носителе – силикагеле, диатомите, целлюлозе, оксиде алюминия. Полярной фазой в этом случае служат неполярные растворители – изооктан, бензол, и др. В обращенно-фазовой распределительной хроматографии неполярный растворитель фиксируют на носителе, а в качестве подвижной фазы используют полярные растворители (вода, спирт, буферные растворы, сильные кислоты) 68

Нанесенные жидкие фазы имеют большой недостаток – они быстро смываются подвижной жидкой фазой с поверхности носителя, особенно, в ВЭЖХ - варианте Поэтому жидкие фазы прививают к носителю. В качестве носителей неподвижных жидких фаз для НФРХ используют силикагели с привитыми нитрильными, аминными и другими группами В обращенно-фазовом варианте используют силикагели с привитыми алкилсилильными группами. Механизм удерживания на таких сорбентах сложен Метод распределительной хроматографии применяют для разделения сильнополярных соединений, аминокислот, фенолов, фенилкарбоновых кислот и др. 69

Особенности жидкостных хроматографов Жидкостной хроматограф – более сложный прибор, чем газовый Система подачи элюента дополнительно включает: Систему дегазации ( пузырьки газа в детекторе делают невозможной его применение) Устройство для создания градиента ( обеспечивает отбор элюента из 2-3 емкостей в смеситель, затем в колонку) Насосы и измерители давления ( дозаторы работают при высоких давлениях, часто используют дозатор с остановкой потока) 70

В ВЭЖХ обычно используют прямые колонки длиной L=10-25 см, d = 4-5,5 мм микроколоночный вариант: (L=5-6 см, d = 1-2 мм ) В жидкостных хроматографах часто используют автоматические коллекторы фракций, что позволяет использовать для количественного анализа другие ФХМА Все объемы соединительных трубок, колонок, ячейки детектора, ввода пробы должны быть как можно меньшими, чтобы избежать внеколоночного размывания пиков 71

Система высокоэффективной жидкостной хроматографии PE 200 Series (PerkinElmer, США)

Определение наркотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 73

Детекторы в ВЭЖХ Рефрактометрический УФ-детектор Детектор на диодной матрице Флуоресцентный Электрохимический Масс-спектрометрический Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия, нефтехимия, биология, биотехнология, медицина, пищевая промышленность, охрана окружающей среды, производство лекарственных препаратов и во многих другиххимиянефтехимиябиология биотехнологиямедицинапищевая промышленность охрана окружающей среды лекарственных препаратов 74

Спасибо за внимание! 75