Введение в ПЦР и методы, основанные на ПЦР Прикладная генетика для зоологов, лекция 3 Мюге Н. С.

Введение в ПЦР и методы основанные на ПЦР : микросателиты (STR), AFLP, RAPD, PCR-RFLP, Inter-SINE PCR и т. п. Правила написания праймеров. Интерпретация данных « фрагментного анализа ». Использование ДНК - маркеров в популяционной генетике, сравнение возможностей микросателлитного и изофермнентного анализа.

История ПЦР Первоначально искусственный синтез ДНК с использованием олигонуклеотидов был предложен в 1971 (!) г. но не нашел применения (Kleppe et al., 1971) Предложен в 1983 г Кэрри Маллисом (Kary Mullis, ( публикация 1985 г ). Нобелевская премия по химии 1993 г. Патент Cetus Corporation, затем продан за Hoffmann-La Roche. Значительно тормозил развитие методов, основанных на ПЦР, неоднократно оспаривался в судах (Du Pont, Promega) Патент истек в 2005 г.!

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) Выделенная ДНК Буфер Mg dNTPs (dA, dC, dT, dG) Taq- полимераза Праймеры (« туда и обратно ») Амплификатор Набор на 100 реакций – от 900 до 2000 руб

Схема ПЦР

Ролик про ПЦР с диска

Эволюция ПЦР. Возможно, « самый первый »

Эволюция ПЦР. Амплификатор Терцик

Эволюция ПЦР. Амплификатор Tetrad Thermal Cycler (MJ Research PTC-225, USA)

Термостойкая ДНК - полимераза Taq- полимераза - Thermus aquaticus Pfu- полимераза - Pyrococcus furiosus Pwo- полимераза - Pyrococcus woesei И др. А также смеси в различных сочетаниях

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) наборы реактивов для ПЦР « Сухие ядра Гаджи Омаровича » ( ИОГЕН, БИОКОМ ) - «… просто добавь воды » - готовый сухой премикс в разовых пробирках - дилюэнт ( разбавитель ) - праймеры - ДНК Вашего организма Плюсы : работает как зверь, не безумно дорого (15 р реакция ), не требует (?) морозильника. Минусы : нет возможности оптимизации по Mg, объему и т. п.

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) наборы реактивов для ПЦР Наборы для ПЦР Силекс ( Хеликон ( и много других Есть возможность оптимизации, HotStart и другие модификации фермента

Оптимизация ПЦР Подбор температуры отжига Титрование по магнию (1.0 – 3.5 mM) Если не помогло : Touch-Down PCR с широким диапазоном t Удлинение отжига и синтеза ( до 2 минут ) Работа с матрицей и с методом экстракции ДНК ( переосаждение ( доп. очистка ), концентрация, разбавление, вырезание из агарозы крупных фрагментов и т. д.) Использование других праймеров Nested PCR

Strictly following the protocol in original publication Grooijmans et. al mfw 1 mfw 4 mfw 7 mfw 9 mfw 16 mfw 28 mfw 31 mfw 1 mfw 4 mfw 7 mfw 9 mfw 16 mfw 31 Adjusted: Touchdown Annealing t o Mg 2+ etc. Оптимизация ПЦР – титрование по Mg. и температуре отжига

ПЦР : правила « хорошего тона » Всегда ставить отрицательный контроль ( вода вместо ДНК ) Ставить положительный контроль ( с заведомо работающей ДНК ) ПЦР - гигиена - не допускать попадания ПЦР - продукта в зону, где Вы собираете реакцию Иметь « свой » набор реактивов и праймеров, пипетки должны быть четко маркированы ( до и после ПЦР разные комплекты ) ПЦР продукты хранятся в отдельном холодильнике, и берутся другим комплектом рук.

Вещества, улучшающие специфичность ( и / или ) выход PCR реакции ВеществоСтокИспользуемые концентрации Механизм действия BSA10 µg/ µl~0.1 µg/ml стабилизация фермент DMSO100% % ( оптимально ~5%) повышение растворимости Glycerol100% 5-20% ( оптимально %) стабилизация фермента Formamid100%1-5% Pyrophosphatase thermostable 5 u/µl u/ реакцию устранение пирофосфатов, которые могут обращать реакцию полимеризации

Влияние на ПЦР реакцию : Веществодействие Агарозане мешает до ~1%. AcONa (pH 5.0) начинает ингибировать при >5mM. EDTA связывается с Mg 2+ стехиометрически, начинает ингибировать при >0.5mM, PCR не идёт при 1mM. DEPC ингибирует реакцию, лучше не использовать в PCR- реакции растворы, обработанные DEPC. Желатин 10µg/ml - не мешает. Изопропанол ингибирование при концентрациях >1% ( более сильный ингибитор, чем этанол ). Масло, покрывающее PCR может устранять ингибирующий эффект некоторых загрязнений. NaCl заметно ингибирует при 25mM, PCR не идёт при 50mM. Сахароза не мешает до 30%. Фенол уменьшает выход при >0.2%, PCR не идёт при 0.5% Этанол для некоторых реакций - стимулирующий эффект при 1%, для других - ингибирование при концентрациях >1%.

Влияние красителей на PCR. Красители : Cresol red 0.2mM Бромфеноловый синий

Праймеры для ПЦР Длина пар оснований GC- состав ~ 4060 %; близкие T m праймеров ( отличия не более, чем на 5 °C); Температура отжига более 55 С и менее 60 С ( если возможно ) отсутствие неспецифических вторичных структур шпилек и димеров ; желательно, чтобы на 3- конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной. Если используем ранее опубликованные праймеры : Внимательно читать раздел методы ! Не верить условиям ПЦР в разделе « методы » ( требуется оптимизация под Ваши реактивы и оборудование )

Праймеры для ПЦР « Универсальные » Баркодинг : С OI (Folmer et al., 1994 HCO2198TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA LCO1490GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG Simon 1991, 1994 – universal primers for arthropods

Праймеры для ПЦР Создание своих праймеров Программы : PrimerSelect (DNASTAR), Oligo Необходимо знать последовательность ( генбанк ) Размер фрагмента Проверка на димеры и шпильки Проверка на ложные сайты отжига

Разработка праймеров – температура отжига

Разработка праймеров – шпильки и димеры

Разработка праймеров – ложные сайты отжига

Создание праймеров на фланкирующие области в программе PrimerSelect (DNAStar).

Nested PCR ( гнездовой ПЦР )

Touch-Down PCR Уменьшение температуры отжига на каждом цикле Удлинение времени отжига на каждом цикле Иногда – уменьшение также и температуры синтеза на каждом цикле

Hot-Start PCR Добавление полимеразы после предварительного прогрева Или : активация инактивированной белками полимеразы предварительным длительным прогревом (10-15 минут ) Или : использование плавких разделителей между полимеразой и матрицей Позволяет избежать удлинения неспецифически севших праймеров, повышает специфичность реакции

Анализ ПЦР реакции Агарозный электрофорез Акриламидный электрофорез Капиллярный электрофорез Нужно : Гель Камера Блок питания Трансиллюминатор