Введение в ПЦР и методы, основанные на ПЦР Прикладная генетика для зоологов, лекция 3 Мюге Н. С.

Презентация:



Advertisements
Похожие презентации
Prezentacii.com. это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей.
Advertisements

Полимеразная цепная реакция Метод, который перевернул современную молекулярную биологию.
Теоретические основы полимеразной цепной реакции.
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего образования «БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Изобретение ПЦР Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис.
РУДН. Кафедра биологии и общей генетики Лекция РУДН. Кафедра биологии и общей генетики Гигани Ольга Олеговна Лекция Синтез ДНК. Нарушения в структуре ДНК.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
ПЦР – метод амплификации, т.е. получения большого числа копий нужного гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь для получения нужной.
Синтез ДНК. Полимеразная цепная реакция. ЛЕКЦИЯ 5.
"Ключевые методы молекулярной биологии. Фрагментный анализ" 1 Докладчик: Шадрин Д.М. е-mail:
Некоторые методы молекулярной биологии Денис Ребриков.
Полимеразная цепная реакция Генерозова Анна, 9 класс «А»
Информация о компании ЗАО «НПФ ДНК-Технология» Основана в 1993 году Специализация: производство оборудования и реактивов для ПЦР, лабораторная диагностика.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ФРАГМЕНТОВ ДНК. Мост из фильтровальной бумаги Агарозный гель Лунки для образцов ДНК Электрод Буферный раствор Направление движения ДНК Источник.
Некоторые методы молекулярной биологии Дей Е.В.. Полимеразная цепная реакция Принцип ПЦР сформулировал Гобинд Корана в 1971 В 1983 Кэри Мюллису удалось.
Wet Lab Смирнов Арсений Пензенцева Евгения. ДНК (4 нуклеотида: А, Т, G, C) 3.
Методики сравнения первичной структуры ДНК. Методики сравнения первичной структуры ДНК: Гель-элетрофорез нуклеиновых кислот. - Р.Цанев Блот-гибридизация.
Молекулярная дифференциация изолятов Phytophthora infestans методом RAPD ПЦР Магистерская диссертация Викторовича В.Н. Научный руководитель: д. б. н.,профессор.
Молекулярно-генетические методы диагностики. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис (Kary Mullis).
Лекция 5 Наталья Володина. Транскрипция Транскрипция, трансляция Альбертс глава 5.
Транксрипт:

Введение в ПЦР и методы, основанные на ПЦР Прикладная генетика для зоологов, лекция 3 Мюге Н. С.

Введение в ПЦР и методы основанные на ПЦР : микросателиты (STR), AFLP, RAPD, PCR-RFLP, Inter-SINE PCR и т. п. Правила написания праймеров. Интерпретация данных « фрагментного анализа ». Использование ДНК - маркеров в популяционной генетике, сравнение возможностей микросателлитного и изофермнентного анализа.

История ПЦР Первоначально искусственный синтез ДНК с использованием олигонуклеотидов был предложен в 1971 (!) г. но не нашел применения (Kleppe et al., 1971) Предложен в 1983 г Кэрри Маллисом (Kary Mullis, ( публикация 1985 г ). Нобелевская премия по химии 1993 г. Патент Cetus Corporation, затем продан за Hoffmann-La Roche. Значительно тормозил развитие методов, основанных на ПЦР, неоднократно оспаривался в судах (Du Pont, Promega) Патент истек в 2005 г.!

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) Выделенная ДНК Буфер Mg dNTPs (dA, dC, dT, dG) Taq- полимераза Праймеры (« туда и обратно ») Амплификатор Набор на 100 реакций – от 900 до 2000 руб

Схема ПЦР

Ролик про ПЦР с диска

Эволюция ПЦР. Возможно, « самый первый »

Эволюция ПЦР. Амплификатор Терцик

Эволюция ПЦР. Амплификатор Tetrad Thermal Cycler (MJ Research PTC-225, USA)

Термостойкая ДНК - полимераза Taq- полимераза - Thermus aquaticus Pfu- полимераза - Pyrococcus furiosus Pwo- полимераза - Pyrococcus woesei И др. А также смеси в различных сочетаниях

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) наборы реактивов для ПЦР « Сухие ядра Гаджи Омаровича » ( ИОГЕН, БИОКОМ ) - «… просто добавь воды » - готовый сухой премикс в разовых пробирках - дилюэнт ( разбавитель ) - праймеры - ДНК Вашего организма Плюсы : работает как зверь, не безумно дорого (15 р реакция ), не требует (?) морозильника. Минусы : нет возможности оптимизации по Mg, объему и т. п.

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) наборы реактивов для ПЦР Наборы для ПЦР Силекс ( Хеликон ( и много других Есть возможность оптимизации, HotStart и другие модификации фермента

Оптимизация ПЦР Подбор температуры отжига Титрование по магнию (1.0 – 3.5 mM) Если не помогло : Touch-Down PCR с широким диапазоном t Удлинение отжига и синтеза ( до 2 минут ) Работа с матрицей и с методом экстракции ДНК ( переосаждение ( доп. очистка ), концентрация, разбавление, вырезание из агарозы крупных фрагментов и т. д.) Использование других праймеров Nested PCR

Strictly following the protocol in original publication Grooijmans et. al mfw 1 mfw 4 mfw 7 mfw 9 mfw 16 mfw 28 mfw 31 mfw 1 mfw 4 mfw 7 mfw 9 mfw 16 mfw 31 Adjusted: Touchdown Annealing t o Mg 2+ etc. Оптимизация ПЦР – титрование по Mg. и температуре отжига

ПЦР : правила « хорошего тона » Всегда ставить отрицательный контроль ( вода вместо ДНК ) Ставить положительный контроль ( с заведомо работающей ДНК ) ПЦР - гигиена - не допускать попадания ПЦР - продукта в зону, где Вы собираете реакцию Иметь « свой » набор реактивов и праймеров, пипетки должны быть четко маркированы ( до и после ПЦР разные комплекты ) ПЦР продукты хранятся в отдельном холодильнике, и берутся другим комплектом рук.

Вещества, улучшающие специфичность ( и / или ) выход PCR реакции ВеществоСтокИспользуемые концентрации Механизм действия BSA10 µg/ µl~0.1 µg/ml стабилизация фермент DMSO100% % ( оптимально ~5%) повышение растворимости Glycerol100% 5-20% ( оптимально %) стабилизация фермента Formamid100%1-5% Pyrophosphatase thermostable 5 u/µl u/ реакцию устранение пирофосфатов, которые могут обращать реакцию полимеризации

Влияние на ПЦР реакцию : Веществодействие Агарозане мешает до ~1%. AcONa (pH 5.0) начинает ингибировать при >5mM. EDTA связывается с Mg 2+ стехиометрически, начинает ингибировать при >0.5mM, PCR не идёт при 1mM. DEPC ингибирует реакцию, лучше не использовать в PCR- реакции растворы, обработанные DEPC. Желатин 10µg/ml - не мешает. Изопропанол ингибирование при концентрациях >1% ( более сильный ингибитор, чем этанол ). Масло, покрывающее PCR может устранять ингибирующий эффект некоторых загрязнений. NaCl заметно ингибирует при 25mM, PCR не идёт при 50mM. Сахароза не мешает до 30%. Фенол уменьшает выход при >0.2%, PCR не идёт при 0.5% Этанол для некоторых реакций - стимулирующий эффект при 1%, для других - ингибирование при концентрациях >1%.

Влияние красителей на PCR. Красители : Cresol red 0.2mM Бромфеноловый синий

Праймеры для ПЦР Длина пар оснований GC- состав ~ 4060 %; близкие T m праймеров ( отличия не более, чем на 5 °C); Температура отжига более 55 С и менее 60 С ( если возможно ) отсутствие неспецифических вторичных структур шпилек и димеров ; желательно, чтобы на 3- конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной. Если используем ранее опубликованные праймеры : Внимательно читать раздел методы ! Не верить условиям ПЦР в разделе « методы » ( требуется оптимизация под Ваши реактивы и оборудование )

Праймеры для ПЦР « Универсальные » Баркодинг : С OI (Folmer et al., 1994 HCO2198TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA LCO1490GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG Simon 1991, 1994 – universal primers for arthropods

Праймеры для ПЦР Создание своих праймеров Программы : PrimerSelect (DNASTAR), Oligo Необходимо знать последовательность ( генбанк ) Размер фрагмента Проверка на димеры и шпильки Проверка на ложные сайты отжига

Разработка праймеров – температура отжига

Разработка праймеров – шпильки и димеры

Разработка праймеров – ложные сайты отжига

Создание праймеров на фланкирующие области в программе PrimerSelect (DNAStar).

Nested PCR ( гнездовой ПЦР )

Touch-Down PCR Уменьшение температуры отжига на каждом цикле Удлинение времени отжига на каждом цикле Иногда – уменьшение также и температуры синтеза на каждом цикле

Hot-Start PCR Добавление полимеразы после предварительного прогрева Или : активация инактивированной белками полимеразы предварительным длительным прогревом (10-15 минут ) Или : использование плавких разделителей между полимеразой и матрицей Позволяет избежать удлинения неспецифически севших праймеров, повышает специфичность реакции

Анализ ПЦР реакции Агарозный электрофорез Акриламидный электрофорез Капиллярный электрофорез Нужно : Гель Камера Блок питания Трансиллюминатор