Дисциплина : биохимия ( С 2. Б.4) Специальность : лечебное дело (060101) НГМУ, кафедра медицинской химии Д. б. н., доцент Суменкова Дина Валерьевна Лекции : ЭНЗИМОЛОГИЯ

ЛЕКЦИЯ 3 КЛИНИЧЕСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ 2

Актуальность темы Широкое использование ферментов в медицинской практике – диагностике и терапии, - диктует необходимость изучения клинических аспектов энзимологии 3

План лекции Применение ферментов как реагентов в диагностике Применение ферментов в качестве лекарственных препаратов Исследование активности ферментов для диагностики заболеваний Энзимопатии 4

Цель лекции Знать : пути использования ферментов в медицинской практике ферменты, используемые в энзимодиагностике и сущность катализируемых ими химических реакций Уметь : трактовать данные энзимологических исследований сыворотки крови 5

Ферменты как реагенты ПРИМЕРЫ : Глюкозооксидаза грибов ( аэробная дегидрогеназа ) – FAD- содержащий специфический фермент для определения глюкозы в моче и крови Используется в глюкозооксидазных биосенсорах β-D- глюкоза + O 2 глюконолактон + Н 2 О 2 6

Ферменты как реагенты Определение лактата в крови для оценки тяжести шока, гипоксических состояний, сахарного диабета с помощью лактатоксидазы и пероксидазы Лактат + O 2 пируват + Н 2 О 2 Н 2 О аминоантипирин + фенол окрашенный комплекс (интенсивность окраски пропорциональна содержанию лактата) 7

Ферменты как реагенты Рестриктазы бактерий ( специфические эндонуклеазы ) используются в пренатальном скрининге наследственных заболеваний Taq- полимераза термофилов (Thermus aquaticus) необходима для проведения ПЦР - анализа в диагностике наследственных и инфекционных заболеваний, определении родства, судебной медицине 8

Энзимотерапия Применение ферментов в качестве лекарственных препаратов Заместительная терапия – использование ферментов в случае их недостаточности ПРИМЕРЫ : лечение желудочно - кишечных заболеваний, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков Препараты панкреатических ферментов трипсина, амилазы, липазы : энзистал, мезим форте, фестал, панкреатин, пензитал 9

Энзимотерапия Комплексная терапия – применение ферментов в качестве дополнительного терапевтического средства ПРИМЕРЫ : фитогидролазы : бромелаин, папаин ( широкая субстратная специфичность, широкий диапазон рН )– пищеварение, косметология, рассасывание тромбов, активация иммунитета, удаление « сшивок » между биополимерами 10

Энзимотерапия коллагеназа ( преп. коллализин )- рассасывание спаек и рубцов ( фиброзных процессов ) после ожогов и операций гиалуронидаза ( преп. лидаза )- лечение фиброзных процессов, увеличение проницаемости тканей для анестетиков 11

Энзимотерапия трипсин, химотрипсин – лечение гнойно - некротических ран, эмфиземы легких, бронхита фибринолизин ( плазмин )– разрушение тромба при тромбозах РНК - аза и ДНК - аза – противовирусное и антибактериальное действие ( аденовирусный конъюктивит, герпетический кератит ) 12

Энзимотерапия аспарагиназа, глутаминаза – лечение лейкозов Лейкозные клетки не способны синтезировать асн и глн – аминокислоты, содержащие амидные группы, поэтому получают их из крови. Гидролитическое дезаминирвание данных аминокислот с образованием аспартата и глутамата ограничивает опухолевые клетки в незаменимых для них аминокислотах, что и приводит к нарушению роста опухоли 13

Энзимотерапия Ингибиторы протеаз в терапии острых панкреатитов 14

Энзимотерапия Ингибиторы протеаз в терапии HCV инфекции - новый класс препаратов для лечения гепатита С Действие препаратов направлено непосредственно на вирус гепатита : они подавляют или блокируют ключевые внутриклеточные этапы размножения вируса В настоящее время в США и ЕС одобрено использование двух таких препаратов – телапревир (Incivek) и боцепревир (Victrelis). Их применение в составе комбинированной терапии существенно повышает эффективность лечения пациентов. 15

Трудности энзимотерапии нестабильность ферментов антигенные свойства трудности доставки к пораженным органам ПРИМЕР : действие фибринолизина не является строго специфичным ( только для фибрина ), он может повреждать факторы свертывания крови, вызывая геморрагический диатез Пути решения проблем Использование иммобилизованных ферментов Направленный транспорт ферментов 16

Иммобилизованные ферменты Иммобилизация ( лат. immobilis – неподвижный ) – связывание молекул ферментов с носителем Преимущества : устойчивость, нерастворимость в воде, пролонгированное действие, возможность многократного использования Носитель : полимер ( целлюлоза, сефароза, агароза, полиакриламид ) Способы иммобилизации : образование ковалентных и нековалентных связей с носителем полимеризация носителя в присутствии фермента инкапсулирование ( например, включение в липосому ) 17

Иммобилизованние ферменты : примеры Иммобилизация протеолитических ферментов на целлюлозе : повязки, тампоны для обработки и лечения ран ( см. слайд 12, повязка с трипсином на диальдегидцеллюлозе ) Иммобилизация ферментов на колонках для экстракорпоральной перфузии крови типа « искусственная почка », « искусственная печень » 18

Энзимодиагностика Постановка диагноза на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека Секреторные ( функциональные ) ферменты синтезируются в печени « работают » в крови ( субстрат фермента находится в крови ) активность в крови такая же или выше, чем в ткани характеризуют белок - синтезирующую функцию печени ПРИМЕРЫ : псевдохолинэстераза ( ПХЭ ) липопротеинлипаза ( ЛП - липаза ) лецитин : холестерол ацилтрансфераза ( ЛХАТ ) проферменты свертывающей системы крови 19

Энзимодиагностика 20 Внутриклеточные ферменты : цитоплазматические : лактатдегидрогеназа ( ЛДГ ), аланин ( аспартат ) аминотрансфераза ( АЛТ, АСТ ), креатинкиназа ( КК ) митохондриальные : АСТ лизосомные : кислая фосфатаза Активность в ткани высокая Активность в крови незначительная и является следствием нормально идущих процессов разрушения клеток ( например, эритроцитов ), повышенной проницаемости мембран в детском возрасте, выполнения тяжелой физической работы ( повышение активности креатинкиназы ) Значительное повышение активности в крови – признак патологии ( воспаление, цитолиз, некроз ) o Появление в крови цитозольных ферментов свидетельствует о воспалительном процессе, митохондриальных или ядерных – цитолизе, некрозе

Энзимодиагностика 21 Экскреторные ферменты Секретируются экзокринными железами Активность в крови незначительная и обусловлена диффузией фермента Активность в крови повышается при воспалении железы, затруднении оттока секрета ПРИМЕРЫ : щелочная фосфатаза ( печень ) амилаза, липаза ( поджелудочная железа ) кислая фосфатаза ( простата )

« Требования » к ферментам энзимодиагностики 22 Органоспецифичность ( тканеспецифичность ) фермента или его изоформ : преимущественная или абсолютная локализация в определенных органах ПРИМЕРЫ : панкреатическая липаза печеночная гистидаза и аргиназа ЛДГ 1 и ЛДГ 2 кардиомиоцитов неспецифические ферменты АЛТ и АСТ проявляют наибольшую активность в печени и сердце Количество высвобождаемого в кровь фермента должно быть пропорционально степени повреждения ткани и достаточно для определения его активности Активность ферментов стабильна в течение достаточно длительного времени ( сутки )

Изоферменты 23 Множественные формы одного фермента, обусловленные различиями в структуре генов катализируют одну и ту же реакцию Различия изоформ физико - химические свойства (I структура, М. м., заряд ) органоспецифичность субстратная специфичность кинетические характеристики : активность, сродство к субстрату способы регуляции, чувствительность к ингибиторам и активаторам

Пример изоферментов 24 ФерментМ. м. кДа ОрганСубстратКм, ммоль / л Активность мкмоль / мин на 1 г ткани Регуляция Гексокин аза (I–III) 104 Раз. Глюкоза Фруктоза галактоза 0.01 Мозг – 10 Сердце – 4.8 Мышцы – 1.5 Жир – 0.15 Продукт - ингибитор Глюкоки наза ( гексоки наза IV) 2000 Печень, Поджел удочная железа глюкоза Печень – 0.4 П. жел. – 2.1 Не аллостери ческий фермент

Изоформы в диагностике 25 Лактатдегидрогеназа ( ЛДГ ) пируват + NADH лактат + NAD + Назовите класс фермента ! Диагностика патологии печени, сердца, мышц Олигомерный белок : 4 субъединицы двух типов М ( англ. muscle – мышца ) Н ( англ. heart – сердце ) Назовите возможные комбинации субъединиц, образующие 5 изоформ !

26

Изоформы в диагностике 27 Креатинкиназа ( КК ) креатин + АТФ креатинфосфат + АДФ Назовите класс фермента! Креатинфосфат – энергетический субстрат в мышечной и нервной тканях Олигомерный белок: димер из субъединиц 2-х типов М ( англ. muscle – мышца ) В ( англ. brain – мозг ) Назовите возможные комбинации субъединиц, образующие 3 изоформы и предположите орган их преимущественной локализации !

28 КК - ММ ( скелетная мышца ) – диагностика повреждений скелетных мышц КК - МВ ( сердечная мышца ) – диагностика инфаркта миокарда КК - ВВ ( головной мозг ) – не проникает через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах ( не имеет диагностического значения )

Почему важно определять изоферментный состав, а не просто суммарную активность фермента ? 29 ПРИМЕР болезнь Тея - Сакса ( ганглиозидоз ) Причина : нарушение синтеза α-субъединиц гексозоаминидазы снижение активности изоформы А Изоформа А (2 α2β) Изоформа В (4β) Суммарная активность фермента при данной патологии нормальная (за счет повышенной концентрации изоформы В)

Задание для самостоятельной работы 30 В современной клинической лабораторной диагностике широко используется метод иммуноферментного анализа ( ИФА ). Изучите информацию о данном методе и составьте конспект по вопросам : 1. Принцип метода ИФА. 2. Роль ферментов как реагентов в ИФА - диагностике. 3. Значение ИФА в диагностике заболеваний.

Задание для самостоятельной работы Заполните таблицу « Ферменты энзимодиагностики » и выясните тип катализируемой реакции для каждого из них 31 Фермент и его изоформыНорма в крови ( с учетом возраста и пола ) Клинико - диагностическое значение Лактатдегидрогеназа ( ЛДГ ) Аланинаминотрансфераза ( АЛТ ) Аспартатаминотрансфераза ( АСТ ) Креатинкиназа ( КК ) Гаммаглутамилтранспептидаза ( ГГТП ) Кислая фосфатаза ( КФ ) Щелочная фосфатаза ( ЩФ ) Псевдохолинэстераза ( ПХЭ ) Панкреатическая липаза и амилаза

Энзимопатии 32 Патологические процессы, основанные на нарушении ферментативного катализа первичные ( наследственные ) нарушается образование конечного продукта ПРИМЕР : дефект тирозиназы нарушение синтеза меланина альбинизм накапливаются токсические метаболиты ПРИМЕРЫ : Фенилкетонурия ( недостаток фенилаланингидроксилазы снижение образование тир из фен): накопление фенилпирувата, фенилацетата токсическое действие на мозг нарушение транспорта тир в мозг снижение синтеза дофамина, норадреналина Алкаптонурия - « черная моча » ( недостаток оксидазы гомогентизиновой кислоты, реакция катаболизма тир ): гомогентизиновая кислота и алкаптоны откладывается в суставах воспаление вторичные ( приобретенные )

Заключение 33 Ферменты используются в диагностике заболеваний как специфические реагенты Препараты ферментов используются в заместительной и комплексной терапии Определение активности ферментов – важный этап диагностики заболеваний, а также контроля эффективности проводимой терапии В основе многих наследственных заболеваний лежит нарушение ферментативного катализа

Литература Березов Т.Т. Биологическая химия: учебник для студ. мед. ВУЗов [Рекомендовано УМО] / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. - 3-е изд., перераб. и доп. -М.: Медицина, с. ( ) 2. Биохимия: учебник для студентов медицинских вузов ВУЗов [Рекомендовано отраслевым министерством] / Е. С. Северин - М.: ГЭОТАР-Медиа, с. (С ) 3. Биологическая химия с упражнениями и задачами: учебник для студентов ВУЗов / ред. С. Е. Северин. - М. : ГЭОТАР- Медиа, с. (С )