Синтез ДНК. Полимеразная цепная реакция. ЛЕКЦИЯ 5.

ПРИНЦИПЫ РЕПЛИКАЦИИ: матричность и комплементарность антипараллельность униполярность прерывистость полуконсервативность (М.Мезелсон, Ф.Сталь, 1958) Возможный механизм репликации предложили Ф.Крик и Дж.Уотсон,1953 г. А.Корнберг, 1957, открытие ДНК-полимеразы I

УСЛОВИЯ РЕПЛИКАЦИИ матрица ферменты (реплисома - многокомпонентный белковый комплекс, осуществляющий двунаправленный синтез ДНК) dNTP (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты) Mg 2+ ATP NTP (для синтеза олигорибонуклеотидов - праймеров )

СПОСОБЫ РЕПЛИКАЦИИ (тета) – тип (сигма) – тип репликация линейных молекул

инициация элонгация терминация точка Ori, от англ. Origin ter - сайты репликон скорость репликации: прокариоты: 1500 пн/сек эукариоты: пн/сек (dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + P-P

ИНИЦИАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ инициаторные белки Dna A,В,С… АТР-зависимая ДНК-геликаза SSB – белки ( англ. Single-stranded binding proteins ) ДНК-топоизомераза (ДНК-гираза)

ЭЛОНГАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ праймаза, праймосома, праймер ДНК-полимеразы фрагменты Оказаки ДНК-лигаза

ДНК-полимераза I 3-экзонуклеаза (С- конец, фрагмент Кленова) 5- экзонуклеаза (N- конец) одиночный полипептид ДНК-полимераза III основной фермент элогнации 3-экзонуклеаза высокое сродство к матрице (процессивность в 60 раз выше, чем у ДНК- полимеразы I) много субъединиц ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ПРОКАРИОТ

праймаза ДНК-полимеразаIII ДНК-полимераза I 5 3

РЕПЛИКАЦИЯ У ЭУКАРИОТ много репликонов, их длина т.п.н. в S-фазе клеточного цикла ДНК-полимеразы: α – работает в постоянном комплексе с праймазой (или сама обладает праймазной активностью), синтез праймеров β - фермент репарации γ - синтез мтхДНК δ - синтез лидирующей цепи, синтез фрагментов Оказаки (?) - при репарации замещает или участвует в синтезе фрагментов оказаки полимеразы лишены экзонуклеазной активности (кроме δ и γ )

РЕПЛИКАЦИЯ У ЭУКАРИОТ факторы репликации: факторы FEN-1 или MF-1 обладают активностью 53- экзонуклеазы и участвуют в созревании фрагментов Оказаки. Для удаления праймеров также используется РНКаза H1 длина фрагментов Оказаки н. теломераза

ТЕЛОМЕРАЗА 1971 г., А.М.Оловников, предсказал механизм защиты хромосом от укорачивания при каждом делении клетки 1984 г., К.Грейдер – открытие теломеразы 2009 г., К.Грейдер, Э.Блекберн, Д.Шостак – Нобелевская премия рибозим, 150 н. РНК удлиняет 3 конец матрицы ДНК

РЕГУЛЯЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ сфингозин – в малых дозах стимулирует, в больших – подавляет синтез ДНК рифампицин и актиномицин D блокируют репликацию ингибиторы гираз (ДНК-топоизомераз)

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ 1983 г. К. Мюллис (1993 г. – Нобелевская премия) В основе – принципы и механизмы естественной репликации ДНК. Позволяет амплифицировать (многократно увеличить количество копий, клонировать) in vitro фрагмент ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. Амплификатор, термоциклер

ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР Используется: в диагностике инфекционных заболеваний для определения генотипа организма для изучения экспрессии генов для идентификации личности для установления родственных связей в молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследованиях с помощью ПЦР удалось амплифицировать фрагменты мтхДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет

MASTERMIX праймер R праймер L буфер 10х смесь dNTP матрица (ДНК) вода деионизированная ДНК-полимераза (Taq-полимераза) вазелиновое масло

ПОЛИМЕРАЗЫ ДЛЯ ПЦР Taq – полимераза (Thermus aquaticus, обитает в горячих источниках), лишена 3-экзонуклеазной автивности Pfu-полимераза (Pyrococcus furiosus, («яростные огненные шарики», экстремально термофильные бактерии, до 103°С), обладает 3-экзонуклеазной автивности, но медленно работает

КАЖДЫЙ ЦИКЛ ПЦР ВКЛЮЧАЕТ 3 ЭТАПА: 1. Денатурация (плавление) (плавление) t 92-94°С 2. Отжиг с праймерами t 50-60°C 3. Полимеризация (элонгация) t 72°

Денатурация I Отжиг с праймерами I Элонгация I Денатурация II Отжиг с праймерами II Элонгация II Итог II цикла

с каждым циклом ПЦР количество ампликонов увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости

ГЕЛЬ - ЭЛЕКТРОФОРЕЗ Агарозный гель, бромистый этидий ДНК – продукт ПЦР

Полиакриламидный гель, окраска солями серебра Фрагментированная ДНК плазмиды

РАЗНОВИДНОСТИ ПЦР «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) – c используется вторая пара праймеров,, с помощь которой амплифицируется полученный ранее ампликон RT-PCR (Reverse Transcription PCR, ПЦР с обратной транскрипцией). Для изучения экспрессии генов. РНК ДНК ПЦР. Ассиметричная ПЦР (Аssimetric PCR) – для амплификации преимущественно одной цепи; используют разные количества праймеров ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) для амплификации фрагментов более 10 т.п.н. Используют две полимеразы (Taq и Pfu).

РАЗНОВИДНОСТИ ПЦР Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) c использованием флуоресцентно меченых атомов, позволяющая отслеживать количество наработанного продукта в каждом цикле ПЦР в реальном времени Multiplex PCR – при использовании нескольких пар праймеров одновременная амплификация нескольких фрагментов