Расширение возможностей серологической диагностики инфекции, вызываемой вирусом гепатита С, с помощью иммуночипов. А.А. Потапова, В.М. Дронова, 1 Т.А. Чеканова, 1 Г.А.Шипулин, 1 М.Л. Маркелов, 1 Е.А. Пудова, Е.А., 1 Н.П. Кирдяшкина, 2 Т.А. Туполева, 2 Ф.П. Филатов, 2 Д.С.Тихомиров, 2 Е.Н. Овчинникова, Н.Н. Потекаев Московский научно-практический Центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения г.Москвы, 1 ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, 2 Гематологический научный цент РАМН, Москва

Рис. 1. Алгоритм исследования сыворотки крови на наличие антител к вирусу гепатита С в скрининговой лаборатории по приказу МЗ РФ Сыворотка крови, направленная на исследование в скрининговую лабораторию 1 этап исследования (по приказу МЗ РФ 384 от г.) -скрининговые ИФТС: в одной общей лунке тестирование АТ к Core- и к NS- белкам 2 этап (по приказу МЗ РФ 384 от г.) – подтверждающие ИФТС с раздельным тестированием АТ к Core- и NS- белкам Не обнаружены анти - ВГС Обнаружены анти-Core и анти-NS Не обнаружены анти - ВГСОбнаружены анти - ВГС Обнаружены анти-ВГС 90% 10%10% анти-Core анти-NS3 анти-NS4 анти-NS5 Обнаружены анти-Core или анти-NS с низкой оптической плотностью (ОП) ИФТС (4 антигена) или иммуноблот

Слайд 3. Целью представленной работы было изучение верификационных возможностей иммуночипов при серодиагностике вирусного гепатита С в случаях выявления в иммуноферментных тест-системах с низкой позитивной оптической плотностью антител, направленных только к одному из антигенов ВГС.

Слайд 4. Согласно ранее разработанному алгоритму*, пробы сыворотки крови, в которых В первичном скрининге коэффициент позитивности** (КП) < 3,13, округленно 3 (практически совпадает с критерием российских и американских исследователей: соответственно КП

Слайд 5. По результатам исследования были выделены следующие группы образцов: Четыре группы низкопозитивных образцов: 1) 16 образцов с антителами к Core АГ ВГС (в первичной ИФТС КП=2,62 ±0,81), а в подтверждающих ИФТС обнаруживалась реактивность только к Core-антигену (КП ИФА =1,95±0,876); 2) 22 образца с антителами к NS3 (в первичной ИФТС КП анти-ВГС =2,42 ±0,66; в ИФТС с раздельным выявлением антител к 4-м антигенам ВГС КП анти- NS3 = 4,79±4,05); 3) 31 образец с антителами к NS4 (в первичной ИФТС КП анти-ВГС в группе составлял 3,04 ±1,89; в ИФТС с раздельным выявлением антител к 4-м антигенам ВГС КП анти- NS4 был равен 2,98±1,72); 4) 2 образца с с антителами к NS5 ( средний КП=2,81) 2 контрольные группы: 5) 9 образцов с высоким КП в скрининге и в подтверждающих тест-системах с раздельным определением антител к Core АГ и антител к комплексу неструктурных антигенов ВГС; 6) 60 образцов с отрицательным результатом тестирования антител к ВГС в ИФА.

Слайд 6. Образцы 6 групп были протестированы в иммуночипах производства ЦНИИ эпидемиологии c раздельно иммобилизованными антигенами (Core-1b, Core-3a, NS3-1b, NS3-3а, c100p, m-51-1b, m-51-3а, NS5-1b, NS5-3а) и раздельным выявлением антител классов M и G. Рис.2. Схема иммуносорбента иммуночипа и пример его флуоресцентного изображения на канале Сy5 (Red) Споты содержат соответственно антиген: 1 NS3-3a, 2 – NS3-1b, 3 – c-100, 4 – m-5-1-3а, 5 – m-5-1-1b, 6 – NS5-3а, 7 – NS5-1b, 8 – Core-3a, 9 – Core-1b, 10 – сорбционный буфер, не содержащий антигены ВГС. Границы эррея – споты, содержащие бычий сывороточный альбумин, меченный флуорофорами Cy5 и Cy3.

п/пИФТС (Core)В ИБИЧ: IgGИЧ: IgM 1+– (Core, слабая реакт-сть)+ Core-3a, Core-1b, NS3-1b, m b– 2+– (Core, слабая реакт-сть)+ NS3-3a, NS5-3a, NS5-1b– 3+– (Core, слабая реакт-сть)+/– NS3-3a+/– NS5-1b 4+– (Core, слабая реакт-сть)+ Core-3a, Core-1b, NS3-3a, NS3-1b, m a, m b, NS5-1b – 5+– (Core, слабая реакт-сть)+/– m b– 6++/– (Core, средняя реакт-сть)+/– Core-3a, Core-1b– 7++/– (Core, средняя реакт-сть)+ Core-3a, Core-1b, c-100, m b+/– NS5-1b 8++/– (Core, средняя реакт-сть)+ Core-3a, Core-1b, NS3-1b, m b+/– Core-3a, Core-1b 9++/– (Core, средняя реакт-сть)+ Core-3a, NS3-1b+/– Core-3a, Core-1b 10++/– (Core, средняя реакт-сть)+ NS3-3a, NS3-1b, m a, m b+/– NS3-1b 11++ (С1, С2)+ Core-3a, Core-1b, NS3-3a, NS3-1b, m a– 12++ (Core, NS3, NS4, геликаза)+ Core-3a, Core-1b, NS3-1b, c-100, m b, NS5-1b+/– Core-3a, *Core-1b 13++/– (Core, средняя реакт-сть)+ Core-3a, Core-3b, NS3-3a, NS3-1b, m a, m b, NS5-1a, NS5-1b – 14++/– (Core, средняя реакт-сть)+ Core-3a, Core-3b, NS3-1b, c-100, m a, m b+ NS3-1b, m5-1-1b 15++/– (Core, средняя реакт-сть)+ Core-3a, Core-1b, NS3-1b, c-100, m b– 16++/– (Core, средняя реакт-сть)+ Core-3a, NS3-3a, NS3-1b, m b+/– m a Слайд 7. Табл.1. Результат исследования в иммуночипах с раздельным выявлением IgG и IgM образцов сыворотки крови с низким коэффициентом позитивности анти-Core ВГС в иммуноферментных тест-системах планшетного формата (указаны антигены, к которым реактивна сыворотка крови).

Слайд 9. Табл.2. Сводная таблица результатов исследований образцов с низкой позитивной оптической плотностью антител к NS3 протеину ВГС в ИФА, иммуноблотах и иммуночипах (результат: «+» позитивный, «–» негативнный, «+/–» неопределенный; «ни» – образец в ИБ не исследован). п/пИФТС (NS3)Результат в ИБРезультат в ИЧ: IgGРезультат в ИЧ: IgM 1+/–– +/– Core – 2+/–– + NS3, NS5, m5-1-1 – 3+/–– +/– m Core, NS 3 4+/–+/– NS3, геликаза + NS3, m5-1-1, NS5, Сore +/– NS 5 5+/–+/–NS3, геликаза + NS3, m5-1-1, NS5, Сore – 6+/–– геликаза + NS3, m b, NS5, Core + NS3-3a, m5-1-1, NS5 7+/–ни + NS3, m5-1-1 – 8+/–ни + NS3, m /– NS5 9+/–– геликаза +/– NS3 + NS3, m5-1-1, NS5 10+/–+ NS3, геликаза, NS4 + NS3, c100, m5-1-1, Core +/– NS5 11+/–+/– NS3 + NS3, m5-1- 1, Core +/– NS5 12+/–ни + NS3, NS5, Core + NS3, m5-1-1, NS5 13+/–ни + NS3, m5-1-1, Core – 14+/–ни + NS3, m5-1- 1, NS5, Сore +/– NS3 15+/–ни + NS3, c-100, m5-1- 1, NS5, Core + NS3, m5-1-1,NS5, Core 16+/–ни + NS3, m5-1-1 – 17+/–+/– NS3, геликаза +/– NS3 – 18+/–+/– Е2 (LIA) + NS3, m5-1- 1, NS5 – 19+/–+/– NS3 + NS3, m5-1-1, Core – 20+/–+ С1, С2, NS3 (LIA) + NS3, m5-1- 1, Core – 21+/–ни + NS3, c-100, m5-1- 1, NS5, Corе +/– NS3 22+/–ни + NS3, Core –

Слайд 10. Результат исследования образцов с антителами к NS3 в иммуночипах: Из 22 проб, в которых в ИФТС обнаруживались только анти-NS3 (результат исследования в ИФА был неопределенным), в иммуночипах 18 проб были признаны анти- ВГС позитивными по наличию IgG. Пять проб из 22 содержали анти-ВГС класса M.

Слайд 11. Табл.3. Результат исследования в иммуночипах образцов сыворотки крови, в которых в иммуноферментных тест-системах планшетного формата выявлялись только анти-NS4 ВГС (* - образцы в ИФТС анти-ВГС-отрицательные). п/п ИФА ИБИЧ: IgGИЧ: IgM 1+/––+ NS3, с-100, m5-1-1, Core– 2+/–– NS NS3-3b, с-100, Core+/– c /––NS NS3, с-100, m5-1-1, Core– 4+/––NS NS3, m5-1-1, NS5, Core+/– Core 5* –+/–NS4 (1+)+ с-100, Core– 6* –+/–NS4 (2+)+ с-100, m5-1-1, Core– 7+/–+/–NS4 (2+)+ NS3, c-100, m5-1-1, Core– 8+/–+/–NS4 (2+)+ NS3, c-100, m5-1-1– 9+/–НИ+ NS3,c-100– 10+/–НИ+ NS3, c-100, m5-1-1– 11+/–НИ+ NS3, c-100– 12+/–НИ+ NS3, c-100– 13+/–НИ+ NS3, c-100, m5-1-1– 14+/–НИ+ NS3, c-100, m5-1-1– 15+/–НИ+ NS3, c-100– 16+/–НИ+ NS3, c-100, m5-1-1, NS5, Core–

Слайд 12. Продолжение таблицы 3 (в ИФТС - только анти-NS4 ВГС). п/пИФАИБ ИЧ: IgG ИЧ: IgM 17+/–НИ+ NS3, c-100– 18+/–НИ+/– c-100, m5-1-1– 19+/–НИ+ c-100, Core– 20+/–НИ+ NS3, c-100– 21+/–НИ+/– c-100– 22+/–+/– NS4+ NS3, c-100, NS5– 23+/–+/– NS4+/– c-100+/–m /–+/– NS4+ NS3, c-100, Core– 25+/–+/– NS4+ c-100, m5-1-1, NS5,Core– 26+/–+/– NS4+ c-100, m5-1-1, Core– 27+/–+/– NS4+ NS3, c-100,Core– 28+/–+/– NS4+/– c-100– 29+/–+/– NS3, геликаза+/– c-100– 30+/–+/– NS3, NS4+ NS3, c-100, m5-1-1, Core+ NS3, c-100, m5-1-1, NS5 31+/–+/– NS3, геликаза+ NS3, c-100, Core+ NS3, m5-1-1, NS5

Слайд 13. Результат исследования образцов с низкой позитивной оптической плотностью антител к NS4 в иммуночипах: Из 31 пробы, в которых в ИФТС обнаруживались только анти-NS4 (результат исследования неопределенный), в иммуночипах результат исследования на наличие анти-ВГС класса G 26 образцов был позитивным вследствие обнаружения антител к антигенам нескольких белков ВГС, а пяти образцов неопределенным вследствие обнаружения реактивности только к антигенам белка NS4. В иммуночипах две пробы были признаны анти-ВГС позитивными по наличию IgM. Образцы 5 и 6 были отрицательными в ИФТС, однако, по сообщению врачей-инфекционистов, данные пациенты ранее были поставлены на учет как больные хроническим гепатитом С. При исследовании в ИБ результат был неопределенным, в иммуночипах – положительным.

Слайд 14. Табл.4. Результат исследования в иммуночипах образцов, в которых в иммуноферментных тест-системах планшетного формата выявлялись только анти-NS5 ВГС *Одна из двух проб была отрицательной и по IgG, IgM. п/пИФАИБ ИЧ: IgG ИЧ: IgM 1*+/–Отриц. 2+/–Отриц. (в ИБ Рекомблот обнаружен НС5-12, 2 балла) + NS5-1b, Core-3a, Core-1bОтриц.

Слайд 15. Общий результат исследования В контрольных группах: В отрицательных в ИФА образцах (кроме 5 и 6, дополнительно исследованных по клиническим показаниям) анти-ВГС в иммуночипах не обнаружены. Во всех анти-ВГС-позитивных в ИФА образцах (с выявлением анти- Core и комплекса анти- NS) наличие антител к ВГС подтверждено в иммуночипах.

Слайд 16. Сравнение результатов исследования образцов опытных групп в ИФА и в иммуночипах Антитела к ВГС с низким КП Результаты в ИФА Результаты определения анти-ВГС класса G в иммуночипе Сравнение с ИФА по позитивным результатам определения IgG % позитивных результатов тестирования анти-ВГС класса M в иммуночипе Анти-Core 100% - позитив. 19% - неопр. 81% - позитивные 6% Анти-NS3 100% - неопр. 19% - неопр. 81% - позитивные 22% Анти-NS4 100% - неопр. 16% - неопр. 84% - позитивные 6%

Слайд 17. Сравнение частоты позитивных результатов в иммуноблотах и в иммуночипах Антитела к ВГС с низким КП в ИФА (количество проб) % позитивных результатов в ИБ % позитивных результатов в иммуночипах Достоверность различий Анти-Core (16) 12%81% P

Слайд 18. Табл. 5. Выявление анти-ВГС в иммуночипах в сыворотке крови пациентов с различным анамнезом. Л. пациент, у которого в течение 5 лет в ИФА результат неопределенный вследствие наличия только анти-NS4; К. пациентка, у которой в течение 5 лет периодически в ИФА обнаруживались анти-Core. Антитела класса G Пациент, результат в ИФА NS3 3a NS3 1b c-100m a m b NS5 3a NS5 1b Core 3a Сore 1b Результат Ю. ИФА +/ Положит. К. ИФА и +, и Положит. Антитела класса М Ю Отрицат. К Отрицат.

Слайд 19. Вывод: В проведенном исследовании продемонстрирована высокая эффективность иммуночипов для верификации наличия антител к ВГС в образцах с неопределенным результатом исследования в ИФА и ИБ, что обусловлено: высокой чувствительностью иммуночипов (не меньшей, чем у планшетных ИФТС); расширением спектра выявляемых антител к ВГС по сравнению с иммуноблотом и ИФА; возможностью раздельного выявления в одной постановке IgG и IgM (показателей активной стадии инфекционного процесса). Для полного комплексного исследования необходимо небольшое количество материала (не более 30 мкл на весь анализ).

Рис. 3. Результаты выявления РНК ВГС в образцах, содержащих анти-ВГС класса М. Использовали коммерческий набор производства ЦНИИЭ: АмплиСенс HCV-Монитор-FRT (количественный тест на РНК ВГС); линейный диапазон измерения - 500–50 млн МЕ/мл. Исследуемые образцы помечены зеленым цветом. Синие - отрицательные контроли, рыжие – калибраторы ВКО, красные – положительные контроли и калибраторы РНК ВГС. Три образца: 14 (в ИФА - анти-Core), 20 и 23 (в ИФА – анти-NS3) имели характерные кривые накопления, но ниже порогового уровня. Поэтому они были оценены как отрицательные.

Авторы выражают искреннюю благодарность за помощь в подборе проб и обсуждении результатов исследования сотрудникам клинико-иммунологической лаборатории по диагностике ВИЧ-инфекции Науменко В.А., Гусеву А.С., Борисовой А.М., Богалей Л.Д., Ипатову П.А., врачу-инфекционисту Борейше Л.В.