Золотавин П. Н. к.ф.-м.н. Петрухин А. Н. Использование двухфотонной флуоресцентной микроскопии для исследования липофусциновых гранул и детектирования клеточных органелл in situ

Цели работы Реализация методики двухфотонной микроскопии с одновременным измерением различных параметров флуоресценции. Исследование липофусциновых гранул. Исследование параметров флуоресценции ДМХ in situ в клетках HeLa. Проверка возможности детектирования клеточных органелл по изменению параметров флуоресценции ДМХ.

Двухфотонная флуоресцентная микроскопия Лучи 4 и 5 попадают в детектор. Полезный сигнал увеличивается Преимущества: Высокая контрастность Объемное сканирование

Схема экспериментальной установки

Экспериментально достигнутое разрешение Объектив: Olympus 100x NA=1,25 8х8 мкм Флуоресцентный микроскоп Горизонтальное и вертикальное сечения шарика Обычный оптический микроскоп Достигнутое разрешение Теоретиче ское Экспери мент. Вертикальное 0,7 мкм 1,3 мкм Горизонтальное 300 нм 400 нм

Изображения липофусциновых гранул А2Е Изо-А2Е Отдельная гранула, изображение получено с помощью АСМ, 4х4 мкм. Скопление гранул, двухфотонная микроскопия, 32х32 мкм.

Сканирование клетки HeLa in situ с помощью флуоресцентного зонда ДМХ (спектр флуоресценции) Z = 0 мкмZ = 4 мкмZ = 8 мкм Изображение культуры клеток HeLa, оптический микроскоп. 4-Диметиламинохалкон (ДМХ) Распределение интенсивности флуоресценции ДМХ в клетке HeLa на разной высоте.

Сканирование клетки HeLa in situ с помощью флуоресцентного зонда ДМХ (время затухания флуоресценции) Z = 0 мкмZ = 2 мкм Z = 0 мкм Распределения времени затухания флуоресценции в клетке (от 0,2 до 2,1 нс) Соответствующие распределения интенсивности флуоресценции

Изменение параметров флуоресценции ДМХ в ядерной мембране Клетка на поперечном срезе: 1- плазматическая мембрана, 2 - цитоплазма, 3 - митохондрия, 4 - ядро, АА – линия, вдоль которой сканируются параметры флуоресценции. Интенсивность флуоресценции F(x) вдоль линии АА (отн. ед.). Положение центра массы спектра флуоресценции (нм). Ширина спектра флуоресценции (нм). Время затухания флуоресценции (нс).

Выводы В работе реализована методика двухфотонной микроскопии. Проследили изменение параметров флуоресценции зонда ДМХ в клетках HeLa. Показано, что по изменениям параметров флуоресценции ДМХ можно различать клеточные органеллы in situ.

Благодарим С.К. Гуларяна, В.Ю. Светличного, А.А. Астафьева за сотрудничество и ценные замечания