Физико-химические методы исследования биологически активных веществ

Лекция 15 Основы хроматографических методов. Классификация методов хроматографии

Хроматография Хроматография – физико-химический метод, используется для разделения веществ аналитические цели препаративные цели Служит для идентификации и количественного определения органических и неорганических веществ

Из истории хроматографии Михаил Семёнович Цвет ( ) День рождения хроматографии – 21 марта 1903г. Доклад М.С. Цвета «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу» Свой метод М.С. Цвет назвал – «хроматография» (запись цвета) Ричард Кун (институт фундаментальной медицины г. Гейдельберг) (1938г. Нобелевская премия по химии за предложенную Цветом адсорбционную хроматографию каратиноидов и витаминов): Альфред Винтерштайн (1915г. Нобелевская премия по химии за исследования хлорофиллов) Арчер Портер Мартин, Ричард Лоуренс Миллингтон Синдж ( 1938г. первый противоточный экстрактор с использованием воды и хлороформа для разделения олигопептидов; 1940г. Использование жидкость-жидкостной хроматографии для разделения аминокислот; 19 ноября 1941г. Статья «Новая форма использования двух жидких фаз для хроматографии» в «Biochemical journal»; 1952г. Нобелевская премия за открытие распределительной хроматографии Арчер Портер Мартин, Энтони Траффорд Джеймс ( 50-е годы первый газовый хроматограф ) Измаилов, Шрайбер (1938г. Первые работы по тонкослойной хроматографии) Шталь (1956г. Использование тонкослойной хроматографии как аналитического метода)

капиллярная газовая хроматография (КГХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ), высокоэффективная ионная хроматография (ВЭИХ), сверхкритическая флюидная хроматография (ВЭИХ), капиллярный электрофорез (КЭ) Современные хроматографические методы:

«Никакое другое открытие не оказало на исследования в органической химии такого огромного продолжительного влияния, как анализ с помощью адсорбционной хроматографии Цвета» Каррер, 1947г.

Принцип хроматографического разделения веществ Неподвижная фаза Подвижная фаза Молекулы разделяемых веществ Эффект разделения основывается на том, что соединения проходят расстояние, на котором происходит разделение, с некоторой, присущей этому соединению задержкой Хроматографический процесс состоит из целого ряда сорбции и десорбции, а также растворения и элюирования, которые каждый раз приводят к новому равновесному состоянию

Классификация методов хроматографии 1)По типу агрегатного состояния фаз; 2) природа элементарного акта; 3) способ относительного перемещения фаз; 4) цель осуществления процесса Газовая хроматография (ГХ) Жидкостная хроматография (ЖХ) распределительная хроматография Газо-твердая адсорбционная хроматография Проявительная (элюентная), Фронтальная, вытеснительная Качественный анализ смеси Количественный анализ смеси, Препаративное выделение веществ

Классификация методов хроматографии По типу агрегатного состояния фаз Газовая хроматография (ГХ) Жидкостная хроматография (ЖХ) летучие вещества, испаряются без разложения вещество должно быть растворимо в каком-либо растворителе Критерии использования метода По типу процесса разделения стационарная фаза – твердая активная основа Адсорбционная Распределительная Принцип: вещества с разной силой адсорбируются на твердой фазе и снова десорбируются Стационарная фаза – жидкость, нанесенная на твердый неактивный носитель Принцип: в зависимости от растворимости, вещества распределяются между двумя несмешивающимися жидкостями По технике проведения Внешняя хроматограмма Внутренняя хроматограмма вещества детектируются вне зоны разделения вещества детектируются в зоне разделения (ТСХ, бумажная хроматография)

Классификация хроматографических методов по агрегатному состоянию фаз, типам процессов разделения и техникам проведения Название методаАнглийская аббревиату ра Агрегатное состояние подвижной фазы Агрегатное состояние стационарной фазы Процесс разделения Техника проведения разделения Жидкость- жидкостная хроматография LLCжидкое распределениеLC (ЖХ), HPLC (ВЭЖХ), TLC (ТСХ), PC (бумажн. хромат.) Газожидкостная хроматография GLCгазообразноежидкоераспределениеGC (ГХ) Жидкостная хроматография LSCжидкоетвердоеадсорбцияLC (ЖХ), HPLC (ВЭЖХ), PC (бумажн. хромат.) Газовая хроматография GSCгазообразноетвердоеадсорбцияGC (ГХ)

Колоночная хроматография стационарная фаза находится в колонке; прием используется как в газовой, так и в жидкостной хроматографии Принципиальная схема хроматографа для колоночной хроматографии Емкость с элюентом Насосная система Ввод пробы Разделительная колонка Детектор Подвижная фаза в ГХ – газ-носитель Подвижная фаза в ЖХ - элюент Самописец Хроматограмма Сигнал вещества, или пик

Хроматограмма Хроматографический пик – концентрация пробы в подвижной фазе на выходе из колонки как функция времени. Пик- качественная и количественная характеристика Качественный анализ: время удерживание одного компонента при одинаковых условиях хроматографирования – постоянная величина. Время удерживания – время, которое проходит с момента введения пробы до регистрации самописцем максимума сигнала. Условия хроматографии, влияющие на время удерживания: тип колонки; состав подвижной фазы; скорость потока подвижной фазы; температура Две возможности проведения достоверного качественного анализа: 1.И пробу и стандарт хроматографируют в разных хроматографических условиях 2. Выбор соответствующих детекторов

Правильная запись данных ГЖХ 1.Номер (шифр) эксперимента или номер образца 2.Количество введенной пробы 3. Используемая колонка (неподвижная фаза и процент ее нанесения, материал носителя, длина (см) 4.Расход газа-носителя 5.Рабочая температура 6.Усиление, используемое для каждого пика 7.Скорость диаграммы Пример: Опыт К-9 1 мкл 10% смазки апиезон APL на хромасорбе W, 200см N 2, 60 мл/мин С Все пики при Диаграмма 60 см/ч

Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) Газо-жидкостная хроматография используется для разделения «летучих» соединений, т.е. соединений с молекулярной массой до 500. Чувствительность метода: позволяет определить до г количества соединения Неподвижной фазой является жидкость, подвижной – газ Жидкая неподвижная фаза - высокомолекулярную нелетучую жидкость (силиконовые масла, углеводородные смазки и высокомолекулярные полиэфиры) Подвижная фазой – газ (азот) Насадочные колонки Капиллярные колонки мм мм

Аппаратурное оформление метода ГЖХ 1 – баллон с газом- носителем; 2 – стабилизатор потока; 3 и 3 ' – манометры; 4 – хроматографическая колонка; 5 – устройство для ввода пробы; 6 – термостат; 7 – детектор; 8 – самописец; 9 – расходомер Механизм распределения компонентов между носителем и неподвижной жидкой фазой основан на растворении их в жидкой фазе Отношение количества вещества в неподвижной фазе к количеству вещества в подвижной фазе представляет собой коэффициент распределения k

Идентификация методом ГЖХ Для идентифицикации соединения в смеси, сравнивают его время удерживания с временем удерживания «подлинного» образца

Количественный анализ с использованием метода ГЖХ W x = k x A x W x – масса вещества, соответствующего пику с площадью А х ; k x - константа пропорциональности, является коэффициентом отклика соединения Х Определение k x проводят двумя методами: Метод внутреннего стандарта Метод внутренней нормализации