Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы Виктория Шкарупо МГНЦ РАМН Лаборатория эпигенетики Москва 2010

Технологические преимущества определения маркеров метилирования в онкологии перед детекцией мутаций/делеций ДНК Нарушения метилирования ДНК – один из наиболее ранних процессов канцерогенеза Частоты аномального метилирования множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе Выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна Анализ метилирования одного гена технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР с одной-тремя парами праймеров. Поиск же мутаций в одном гене требует использования до нескольких десятков пар праймеров, кроме того, удовлетворительная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР.

Технологические преимущества определения маркеров метилирования ДНК в онкологии перед детекцией маркеров экспрессии на уровне РНК Стабильность ДНК значительно выше Аномально метилированную ДНК можно детектировать в плазме крови и других биологических жидкостях (неинвазивные / низкоинвазивные тесты) Аномальное метилирование – качественный, а не количественный признак, поэтому на достоверность его определения не влияет присутствие молекул нуклеиновых кислот из нормальных тканей

Масштабный скрининг метилирования ДНК Высокая чувствительность молекулярно-генетических маркеров канцерогенеза может достигаться на уровне единичных маркеров Удовлетворительная специфичность молекулярно- генетических маркеров канцерогенеза достигается только при использовании панелей маркеров Современные подходы к масштабному скринингу метилирования Полногеномное секвенирование метилома Скрининг дифференциального метилирования геномов

Цель: разработка современного высокотехнологичного метода скрининга дифференциального метилирования ДНК Анализ ранее опубликованных подходов; выбор и обоснование методической базы исследования Разработка лабораторного протокола метода скрининга дифференциального метилирования ДНК Разработка методов картирования выявляемых дифференциально метилированных локусов Проведение скрининга дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы (РМЖ); характеристика нормальных и опухолевых метилотипов Картирование и характеристика частот аномального метилирования конкретных выявленных локусов при РМЖ Задачи:

Метод амплификации интерметилированных сайтов ( АИМС ) Frigola et al., 2002

Компьютерная программа PeakPick: анализ и сравнение реальных электрофореграмм

Картирование продуктов АИМС при дискриминации капиллярным электрофорезом 1. Секвенирование соответствующих индивидуальных фрагментов 2. Рестрикционное картирование на основании анализа AIMS in silico

Дизайн эксперимента с помощью программы AIMS in silico рестриктаз удлинителей праймеров, дискриминирующих различные геномные элементы, например, CpG-островки или рассеянные повторы. удлинителей праймеров, ограничивающих количество ожидаемых продуктов АИМС до значений, приемлемых при анализе капиллярным электрофорезом. Выбор:

Полная репрезентация АИМС in vitro - CpG-метилаза M.SssI - XmaI АИМС

Полная репрезентация АИМС

Позиционирование продуктов АИМС на капиллярной электрофореграмме Рестрикционное картирование на основании анализа AIMS in silico C2CD2-5-CpG Межгенный 13q32.1-CpG PHF-5-CpG 12q CpG неохарактеризованные сплайсируемые РНК Рестриктазы:NotI - C2CD2-5-CpG AscI - PHF-5-CpG GsaI - межгенный CpG-островок 13q32.1 AvrII - 12q CpG

Скрининг дифференциального метилирования: нормальные и опухолевые метилотипы. Дизайн: удлинитель ccg интронный-CpG- островок CUX1 ZBTB4-3-CpG Х-сцепленный IQSEC2 – 5-CpG C12orf32- 5-CpG FOXM1-5-CpG ANK3- 5-CpG

Скрининг дифференциального метилирования: нормальные и опухолевые метилотипы. Дизайн: удлинитель gcg интронный участок гена MAD1L1 LAMB1 5-CpG 11q CpG неохарактеризованные сплайсируемые РНК

Дифференциально метилированный участок интрона 1 гена ATP2B4 расположен в окне открытого хроматина.

Дифференциально метилированный интронный участок гена MAD1L1

В каждом из образцов опухолевых тканей показано аномальное метилирование по крайней мере одного из проанализированных CpG-островков. Ген (локус) Частота метилирования при РМЖ, % Частота метилирования в условно нормальных образцах молочной железы, % Наличие метилирования в клетках Jurkat ANK300+ ATP2B44225 EST CN C2CD230+ AX AK TMEM176A120 TMEM176B100 FOXM170 C12orf3220 KIAA1324L100 ITGA970 Межгенный CpG-островок (13q32.1) 80

Клинико-генетические ассоциации

С помощью критерия 2 (c поправкой Йейтса) было проведено сравнение частоты метилирования KIAA1324L(121) и ATP2B4(129) в группах с протоковым и смешанным типами РМЖ, которые обнаружили статистически значимые различия (СЗР) для обоих генов (p

Клинико-генетические ассоциации Выявлена заметная ассоциация метилирования KIAA1324L(121) и ATP2B4(129) со стадией развития 2Б. При этом сравнение трех групп (со стадиями развития 2А, 2Б и 4) критерием 2 (c поправкой Йейтса) выявило различие между ними (p

Клинико-генетические ассоциации

Группа с низким индексом метилирования была ассоциирована с протоковым типом РМЖ ; смешанный гистологический тип оказался характерен для группы с высоким индексом метилирования ; статистически значимых различий в группах пациентов с дольковым типом обнаружено не было. Группа с низким индексом метилирования была ассоциирована с протоковым типом РМЖ (p 0,05).

Клинико-генетические ассоциации СЗР между высоко- и низкометилированными группами обнаружили: 1 (низкометилированная группа) и 4 (высокометилированная группа) степени развития (p 0,05).

Клинико-генетические ассоциации Статистически значимых различий между группами, разделенными по клиническому признаку «Степень дифференцировки» обнаружено не было. Статистически значимых различий между группами, разделенными по клиническому признаку «Степень дифференцировки» обнаружено не было (p>0,05).

Выводы 1. Разработан лабораторный протокол метода, который позволяет осуществлять: поиск и характеристику дифференциально метилированных промоторных и др. CpG- островков; характеристику особенностей метилирования различных структурно-функциональных элементов генома; характеристику особенностей метилирования различных структурно-функциональных элементов генома; скрининг аномального метилирования в диагностике, в т.ч. ранней. 3. Разработан метод картирования выявляемых дифференциально метилированных локусов.

Выводы 3. Скрининг дифференциального метилирования геномов клеток РМЖ выявил аномальное метилирование одиннадцати CpG – островков (восемь из которых представляют собой участки промоторных CpG- островков; два – интронных C,G-богатых участка генов ATP2B4 и МАD1L1, не классифицированные как CpG-островки и один – межгенный CpG-островок). 4. Характеристика частот аномального метилирования выявленных генов показала статистически значимые различия между высоко- и низкометилированными группами для следующих клинических признаков: протоковый РМЖ (высокий индекс метилирования), смешанный (низкий индекс метилирования), 1 стадия развития (низкий индекс метилирования), 4 стадия развития (высокий индекс метилирования).

Благодарности Стрельников Владимир Викторович, к.б.н., в.н.с. Танас Александр Сергеевич, н.с. Кузнецова Екатерина Борисовна, к.б.н, ст.н.с. Спасибо за внимание !

Определение метилирования одного локуса методом метилчувствительной ПЦР М – маркер молекулярной массы ДНК О – отрицательный контроль ПЦР (H 2 O) П – положительный контроль ПЦР (ДНК) о – гидролизованная ДНК из тканей опухолей н - гидролизованная ДНК из прилежащих нормальных тканей

Определение метилирования методом мультилокусной метилчувствительной ПЦР N33, CD44, GSTP, RASSF1, GPX3, SFRP – анализируемые гены НВВ – внутренний контроль ПЦР

Анализ метилирования ДНК из клеток линии Jurkat, культивированных в присутствии 5-Aza-dc

Области приложения разработанного программного обеспечения Дизайн и анализ результатов экспериментов: - АИМС - амплификации неметилированных Alu- повторов - количественного анализа совокупного геномного метилирования Alu-повторов - детекции экстраметилированных сайтов - детекции экстранеметилированных сайтов Анализ результатов фрагментного анализа