Преаналитический этап в коагулологии. Понятие о коагулограмме и контроле качества проводимых исследований.

Принципы коагуляционных тестов. Клоттинговые: -мануальное определение -автоматическое определение Хромогенные: -двухточечное измерение -кинетическое измерение

Фибриноген повышается при: воспалении (БОФ) гиперлипопротеидемии сахарном диабете гипертензии ожирении стрессе курении

Принципы коагуляционных тестов. Хромогенный субстрат состоит из короткой пептидной цепи, связанной с красителем (например, pNA). Окрашивание развивается при от- щеплении молекулы красителя от пептидной цепи под действием акти- вированного фактора свертывания. Интенсивность развившейся окраски служит методом оценки активности.

Принципы коагуляционных тестов. Иммунологические: -радиальная иммунодиффузия -электроиммунодиффузия -латексная агглютинация -нефелометрия и турбидиметрия -иммуноферментный анализ -радиоиммуноанализ

Принципы коагуляционных тестов. Молекулярно-генетические исследо- вания для выявления мутаций, от- ветственных за развитие заболева- ний, основанные на методе полиме- разной цепной реакции (ПЦР).(Гемо- филия А, В, болезнь Виллебранда, на- следственный дефицит ATIII, проте- инов C и S, фактора Лейдена, XII).

Антикоагулянт Na 3 C 6 H 5 O 7. 2 H 2 O M.м. 294,12 (3,13г/100мл) Na 3 C 6 H 5 O 7. 5,5 H 2 O M.м.357,18 (3,8г/100мл) 0,106 моль/л Цитрат предотвращает коагуляцию за счет связывания ионов кальция.

Взятие образца Кровь берется из периферической (чаще кубитальной) вены Кровь берется в цитрат в соотношении 1:10 (1 объем цитрата к 9 объемам крови) Неправильное соотношение влияет на результаты теста (концентрация цитрата, разбавление крови)

Разведение более 1:12 (добавление боль- шего объема крови) ведет к активации свертывания, что проявляется в укорочении времени свертывания. Добавление малого количества крови ведет к большему разведению плазмы и удлинению времени свертывания за счет разведения всех компонентов плазмы и кальция в стандартных реаген- тах.

Ht между 25% - 55% не оказывает существенного влияния на результаты скрининговых тестов. При Нt более 55% (у новорожден- ных, при полицитемии и др.) отно- шение кровь/цитрат должно быть скорректировано.

Процедура взятия крови. Цель наложения жгута (манжеты) при взятии крови - предотвра- тить обратный ток венозной крови при сохранении кровотока в капиллярах.

Процедура взятия крови. Давление жгута (манжеты) должно быть ниже диастолического примерно на 10 мм. рт.ст. Компрессия более 60 сек. или с из- быточным давлением ведет к ло- кальной активации фибринолиза и возрастанию активности некоторых факторов.

Стаз длительнее 3 минут приво- дит к: укорочению ПВ, АПТВ, ТВ увеличению примерно на 10% уров- ня фибриногена, АТ III Увеличению примерно на 20% фак- тора Y III:С

Процедура взятия крови. Важно во время взятия крови макси- мально ограничить контактную актива- цию факторов свертывания крови и тромбоцитов. В этом процессе ведущую роль играют смачиваемость поверхности игл и про- бирок. Игла должна быть с широким просве- том, сухая и силиконированная.

Методы взятия: «бабочкообразная» игла - кровь забирается в силиконизирован- ную стеклянную центрифужную пробирку или пластиковую пробирку, градуированную, содер- жащую антикоагулянт.

Методы взятия: Моноветт(аспирационный ме- тод)- градуированный шприц, со- держащий раствор цитрата нат- рия (коммерческая система) Вакутейнер (вакуумный метод)- коммерческая система, содержа- щая раствор цитрата натрия

СТАД пробирки - коммерческие пробирки, содер- жащие кроме цитрата натрия, теофилин, аденозин и дипирида- мол, которые предотвращают активацию тромбоцитов за счет повышения концентрации цАМФ.

СТАД пробирки применяются при: определении факторов тромбо- цитов (PF4, -тромбоглобулина) определении гепарина у пациен- тов, получающих гепарин (НФГ и НМГ) - АПТВ и ТВ могут быть ложно нормальными определении ингибитора актива- тора плазминогена (PAI-1)

СТАД пробирки существуют в виде вакутейнеров пробирка после взятия крови должна немедленно помещаться в ледяную баню образцы должны центрифугиро- ваться в криоцентрифуге (+2 о - +8 о С) скрининговые тесты могут выпол- няться из СТАД плазмы

Взятие образца Первый мл крови должен быть «выброшен», или для исследования гемостаза должна быть взята вторая пробирка Кровь должна течь быстро и «са- мотеком» Кровь должна быть перемешана с антикоагулянтом немедленно после взятия

Взятие образца Аккуратная проверка образцов кро- ви позволяет избежать следующих ошибок: неправильное соотношение кровь/цитрат частично свернувшаяся кровь гемолиз иктерическая или липемическая плазма

Взятие образца Исследование крови из центрально- го катетера должно проводиться в исключительных случаях. На результаты влияет: мертвое пространство внутри кате- тера с возможным стазом крови активация свертывания на стенке катетера применение инфузионных растворов и гепарина

Взятие образца капиллярной крови (в соответствии со стандартом DIN D) Чистое и сухое место кончика пальца или ушной мочки пациента пунктируется стерильным скарификатором. Прокол должен быть достаточно глубоким. Недо- пустимо давление или сжатие. Необходимое количество крови (10-50мкл) забирается в стерильный капилляр в тече- ние 10 сек. Капиллярная кровь использу- ется для адаптированных методов.

Центрифугирование крови Цитратная плазма богатая тромбо- цитами - центрифугирование в тече- ние 5 мин.при 100g (примерно 800 об/мин стандартной центрифуги). Торможение центрифуги должно быть плавное. Супернатант исполь- зуется для исследования функции тромбоцитов.

Центрифугирование крови Цитратная плазма, бедная тромбо- цитами - кровь центрифугируется 10 мин. при g ( около 3000 об/мин) В такой плазме тромбоциты содер- жатся в малых количествах. Используется для большинства тест- ов.

Центрифугирование крови Цитратная плазма, бестромбоцит- ная- плазма бедная тромбоцитами центрифугируется 20 мин. при 2500 g ( около 4000 об/мин) При необходимости замораживается бестромбоцитная плазма.

Относительная центробежная сила(g) может быть рассчитана с помощью уравнения или по номограмме. Rcf = 1,118 x x r x n 2 r - среднее радиальное расстояние от оси вращения в см n - скорость вращения в об./мин. 1,118 х константа, учитываю- щая ускорение силы тяжести

Температурные режимы хранения проб. образцы должны храниться при комнатной температуре, если иссле- дуютя в ближайшее время необходимо избегать повышенных температур хранение в холодильнике(+4 о С) ведет к холодовой активации YII, XI, XII факторов

Температурные режимы хранения проб. скрининговые тесты должны быть выполнены в течение 4 часов после взятия крови исследование фактора YIII в тече- ние 2 часов после взятия крови более длительное хранение выдержи- вают факторы II, YII, X, ATIII, про- теин С, кофактор ристоцетина

Температурные режимы хранения проб(при замораживании). YIII фактор сохраняется: - 2 недели при - 20 о С -до 1 года при - 70 о С при замораживании/оттаивании вос- производимые результаты наблюдаются, если плазма не содержит фибрин-моно- меров, ПДФ и гепарина (после оттаива- ния удлиняется АПТВ, ТВ и РВ, отрица- тельный тест на РФМК)

Положение тела - влияет на количество форменных элементов, концентрацию белков, особенно у больных с отеками. Уровень этих параметров выше у пациентов в вертикальном положе- нии. Для получения сравнимых результа- тов образцы крови должны забирать- ся при одном и том же положении тела.

Синтез факторов свертывания начи- нается с 10 недели эмбрионального периода. Уровень факторов варьирует как у недоношенных, так и доношенных новорожденных. Фибриноген и фактор YIII к рожде- нию достигают уровня взрослого че- ловека, а остальные - в течение 6 ме- сяцев.

Факторы свертывания подвержены циркадным изменениям. Наименьшие концентрации фибри- ногена и других факторов наблю- даются в начале ночи. Другие параметры могут иметь иной биоритм (например, максимум PAI-1 - между 2 и 6 часами ночи), а у ATIII не выявлено суточных колебаний. С учетом возможных колебаний взя- тие крови проводить от 7 до 9 час.утра

Физический и эмоциональный стресс: АПТВ укорачивается концентрация ф.YIII увеличивается концентрация ФВ увеличивается активность t-PA увеличивается скриниговые тесты на фибринолиз становятся патологическими

Диета и гемостаз пища с высоким содержанием живот- ных жиров : ФАК фрукты и свежие овощи : ФАК Рыбная диета: тромбоциты, фибри- ноген, агрегация тромбоцитов чеснок: фибриноген, агрегация тромбоцитов

Диета и гемостаз дисбаланс кишечной флоры (напри- мер,после антибиотикотерапии), нару- шение всасывания жиров в кишечни- ке может привести к дефициту вита- мина К кофеин (кофе и т.д.) приводит к увеличению t-PA и снижению актив- ности PAI-1

Диета и гемостаз алкоголь вызывает: АТIII, Ф - сни- жение, PAI-1, t-PA, кофактор ристо- цитина - возрастание хронический алкоголизм :снижение количества тромбоцитов кокаин : увеличение аграгации тром- боцитов, тромбоцитопения курение:увеличение агрегации, адге- зии, освобождение t-PA, увеличение Ф, снижение активности ф.YII

Лекарства и гемостаз. Анальгетики(индометацин, ибупро- фен, напроксен, фенилбутазон, дикло- фенак) -ингибируют агрегацию тром- боцитов Оральные контрацептивы: снижение ATIII, увеличение агре- гации тромбоцитов Аспарагиназа: снижение Ф, ATIII, Pr.C и S витамин-К зависимых фак- торов, плазминогена

Лекарства и гемостаз. Кровозаменители(декстраны):сниже- ние адгезии и агрегации тромбоци- тов, увеличение ВК, укорочение ТВ и РВ Антибиотики: дефицит витамина К Вальпроевая кислота:тромбоцитопе- ния, снижение Ф, «приобретенный» синдром Виллебранда

НОРМАЛЬНАЯ ПЛАЗМА (НП) (референтная, 100% значения) пул цитратных бестромбоцитных плазм, полученный от 20 или более клинически здоровых людей, иссле- дованных на отсутствие нарушений гемостаза. Лиофилизированная НП должна быть калибрована производителем против свежей или свежезаморожен- ной НП ( -70 о С)

Референтная плазма (100% значения)- централизованно приготовленная нормальная плазма, критерии и процедура приготовления котор- ой определены в стандарте DIN

КАЛИБРОВОЧНАЯ ПЛАЗМА (значения могут отличаться от 100%, но должны быть точно определены по сравнению с референтной, нормальной плазмами). Используется для многоточечной калибровки. Существует набор калибровочных плазм с различной концентрацией или активностью. Их использование предотвращает разведение факторов.

КАЛИБРОВОЧНЫЕ КРИВЫЕ. Взаимосвязь между временем и активностью чаще нелинейна. Для линейного представления калибро- вочной кривой используются раз- личные системы координат: обратная ( для ПВ) полулогарифмическая(для факторов) факторы калибровки (при использо- вании для определения ATIII методи- ки с хромогенным субстратом)

Гепарины нефракционированный гепарин (НФГ)-смесь фракций с разной длиной полимерной цепи и имеет м.м. от до Д низкомолекулярные фракции гепарина (НМГ) имеют м.м. от до Д

Гепарины Связывание гепарина с АТIII превращает по- следний из медленно действующего ингиби- тора в очень быстрый ингибитор. НФГ (IIa + ATIII + НФГ) и (Ха + ATIII + НФГ) НМГ не могут надежно образовывать (IIa + ATIII + НМГ) преимущественно блокирует фактор Ха

СХЕМА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Внутренний механизм Внешний механизм XII XIIa + Калликреин,ВМК Тканевой активатор IX + XI a YIIa+ТФ+ Са 2+ Ca 2+ IXa X YII АТ III + гепарин XI Са 2+, ф/липиды YIIIa Xa Ca 2+ ф/липиды Ya II IIa YIII Y IIa фибриноген фибрин

АП(Ч)ТВ АКТИВИРОВАННОЕ ПАРЦИАЛЬНОЕ (ЧАСТИЧНОЕ) ТРОМБОПЛАСТИНОВОЕ ВРЕМЯ Отражает изменение активности факторов ВНУТРЕННЕГО пути свертывания крови: YIII, IX, XI, XII, X, Y, II, I Тест чувствителен к ГЕПАРИНУ, ингибиторам

АПТВ К плазме без тромбоцитов добавляют: активаторы контактной фазы свертывания (каолин, силикаты, эллаговая кислота ) парциальные тромбопластины (фосфолипидная смесь, заменяющая PF 3) хлорид кальция

АПТВ Тест не стандартизован ВОЗ. В качестве заменителя PF3 использу- ют тромбоциты, ФЛ животного проис- хождения(мозг кроликов, быка или человека), растительные ФЛ (сои), смесь растительных и животных ФЛ, ФЛ мембран эритроцитов человека (эрилид, эритрофосфатид). Реагенты отличаются по типу активатора (као- лин, эллаговая кислота, буфер и т.д.)

ПРИЧИНЫ УДЛИНЕНИЯ АПТВ: снижение активности факторов вну- треннего пути активации свертыва- ния наличие гепарина в пробе наличие в пробе продуктов дегра- дации фибрина/фибриногена (ПДФ) наличие в пробе патологических ингибиторов

Лабораторный контроль НФГ определяется дозами и путем введения препарата. Дозы менее ЕД/сутки считаются профилактическими (200 ЕД/кг/день) - не требуют лабораторного мониторинга.

Лабораторный контроль терапевти- ческих доз НФГ( ЕД/кг/день) __________________________________ Метод Время взятия АПТВ пациента введения крови АПТВ до введения ___________________________________________ Перфузия Любое время 2 - 2,5 (НФГ 0,4-0,6 ЕД/мл) В/В 1 час до следую- 1,5 - 2 (НФГ 0,15-0,3 болюсно щей инъекции ЕД/мл) П/К Между 2 инъек ,5 (НФГ 0,4-0,6 2-3 раза/д. циями ЕД/мл )

НМГ (соотношение анти-Ха / анти - IIа) ФРАКСИПАРИН (надропарин кальцие- вая соль) - 3,5 : 1 ФРАГМИН (дальтепарин натриевая соль) - 2,2 : 1 КЛЕКСАН, ЛОВЕНОКС (эноксапарин натриевая соль) - 3,9 : 1

Контроль за лечением НМГ Допустимо профилактическое назна- чение препаратов НМГ с учетом массы тела пациента в дозировке, рекомендуемой производителем, без лабораторного мониторинга.

Контроль за лечением НМГ Терапевтическая концентрация НМГ дол- жна соответствовать определенному уровню анти - Ха активности плазмы (0,2 - 0,4 МЕ/мл). Не осуществляется контроль по АПТВ, т.к. НМГ обладает преимущественно анти-Х-а действием. Оценка анти Х-а активности с использова- нием хромогенного субстрата не входит в международные протоколы.

Мониторинг достигаемых эффектов терапии НМГ -динамика уровня эндогенной тромбинемии: РФМК тромбин-антитромбиновый комплекс фрагменты протромбина 1+2 Д-димер

СХЕМА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Внутренний механизм Внешний механизм XII XIIa + Калликреин,ВМК Тканевой активатор IX + XI a YIIa+ТФ+ Са 2+ Ca 2+ IXa X YII XI Са 2+, ф/липиды YIIIa Xa Ca 2+ ф/липиды Ya II IIa YIII Y IIa фибриноген фибрин ПротеинС +протеин S Тромбомоду- лин,тромбин АРС

АНД препятствуют образованию в гепатоците полноценных карбоксилированных факторов, образуя PIVKA ( Proteins, Induced in Vitamin K Absence ), у которых снижена способность связывать ионы кальция.

Предшественники фактора свертывания «Полный» фактор свертывания Восстановленный витамин К Эпоксид витамина К Эпоксидредуктаза витамина К ВАРФАРИН активация ингибирование

Варфарин обеспечивает более стабильное воздействие на процесс свертывания крови. Фенилин токсичен. Пелентан обладает неустойчивым антикоагулянтным эффектом.

Протромбиновое время удлиняется: при заболеваниях печени при приеме антагонистов витамина К при дефиците витамина К коагулопатии потребления

Тест Квика отражает нарушение активности трех витамин-К зависимых факторов (YII,X,II), фибриногена и фактора Y Основным реагентом является тромбопластин,содержащий тканевой фактор и фосфолипиды.

ВЛИЯЮТ НА ТЕСТ: тип используемого тромбопластина (полученный из разных органов и видов животных) тип добавок в реагент (ф.Y,I и антаго- нисты гепарина измерение мануальное или автоматичес- кое использование плазмы или капиллярной крови

ПРОТРОМБИНОВЫЙ ИНДЕКС (ПИ) протромбиновое время нормальной (100%) плазмы ПИ= х100% протромбиновое время образца

ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ В ПРОЦЕНТАХ (%) КАЛИБРОВОЧНАЯ КРИВАЯ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ ПЕРЕСЧЕТА ПРОТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ ПАЦИЕНТА В % ОТ НОРМЫ (% АКТИВНОСТИ ФАКТОРОВ ПРОТРОМБИНОВОГО КОМПЛЕКСА)

ПРОТРОМБИНОВОЕ ОТНОШЕНИЕ (ПО) протромбиновое время образца ПО= протромбиновое время нормальной (100%) плазмы

МНО определяется как ПО, полученное при использовании тромбопластина, приготовленного в соответствии с международными стандартами. Необходимо знать его международный индекс чувствительности (International Sensitivity Index, ISI)

ПВ пациента ПВ нормальной плазмы МНО (INR) = МИЧ (ISI) МНО = Международное Нормализованное Отношение МИЧ = Международный Индекс Чувствительности Определение МНО

Пример расчета МНО Отношение ПВ (РНП лиофил )/ ПВ свеж.плазмы =1,14 ПВ (РНП,контроля) =16 сек. ПВ (100%) = 16/1,14 = 14 (сек) ПВ(пациента) = 37 сек. ПО = 37 / 14 = 2,64 МИЧ = 1,2 МНО = 2,64 1,2 = 3,2

Пример расчета МНО МНО=(ПВ(пац.)/ПВ(РНП)хК) мич К=0,88 ПВ (РНП,контроля) =16 сек. ПВ(пациента) = 37 сек. ПО = 37 / 16х0,88 = 2,63 МИЧ = 1,2 МНО = 2,63 1,2

Доза варфарина назначается в ч. МНО на следующий день не исследуется. МНО на 2 день и далее исследуется в 9-11ч. Больные имеют высокую, обычную и низкую чувствительность к варфарину, что влияет на применяемую дозу с учетом показаний МНО.

Показания к применению АНД МНО Профилактика и лечение венозных тромбозов 2,0 - 3,0 Лечение ТЭЛА Инфаркт миокарда Мерцательная аритмия Тканевые протезы клапанов сердца_______________________________ Механические клапаны сердца 2,5 - 3,5

Уровни МНО: высокий - МНО от 2,5 до 3,5 средний - МНО от 2,0 до 3,0 низкий - МНО от 1,6 до 2,0 Периоды: нестабильный - до 6 недель от начала приеме АНД стабильный - после 6 недель от начала приема

Элиминация кумаринов из крови у стариков замедлена: МНО следует поддерживать на уровне 1,4 - 1,7 Кожные некрозы- в первые дни приема варфарина (от 3 до 8 дня)-депрессия протеинаС: тромбируются микрососуды в коже.

Ослабляют эффект АНД Повышенное поступление витамина К с пи- щей (вегетарианское питание, географические особенности питания) Связывание АНД в кишечнике (холестирамин) Стимуляция активности системы цитохрома Р450 в печени,повышающей метаболизм АНД (медикаменты, хронический алкоголизм) Генетическая резистентность к АНД Снижение катаболизма факторов II,YII, IX, X, протеинов С,S и витамина К (гипотиреоз)

Усиливают эффект АНД Недостаточное поступление витамина К с пищей Недостаточная абсорбция витамина К в кишечнике (малабсорбция, обструкция желчевыводящих путей) Недостаточная продукция витамина К в кишечнике (антибиотики) Взаимодействие с циклом витамина К (второе и третье поколение цефалоспоринов) Повышение катаболизма факторов II,YII,IX.X, протеинов C,S и витамина К (гипертиреоз)

Коагучек ® С Портативный экспресс- коагулометр Diagnostics

АНТИАГРЕГАНТЫ АСПИРИН(ТРОМБОАС и др.) - ингибитор циклооксигеназы (СОХ-1) КЛОПИДОГРЕЛЬ (ПЛАВИКС), ТИКЛОПИ- ДИН (ТИКЛИД) - блокаторы АДФ-рецепторов СУЛОТРОБАН,ПИКОТАМИД - ингибиторы тромбоксансинтетазы ВАНИПРОСТ - блокатор тромбиновых рецепторов REO PRO, ИНТЕГРИЛИН - антагонисты IIb/IIIa рецепторов ИЛОПРОСТ, БЕРАПРОСТ - производные простациклина ТРЕНТАЛ,КУРАНТИЛ -комплексное действие

КОНТРОЛЬ ЗА АНТИАГРЕГАНТНОЙ ТЕРАПИЕЙ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ПО АГРЕГАЦИОННОЙ ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ. При применении ПЛАВИКСА, ТИКЛИДА - исследуется АДФ_агрегация. При применении аспирина и его аналогов - адреналин-агрегация. Эффективной терапия считается при снижении показателей агрегатограммы в 3-4 раза от исходных цифр.

Биологическая вариация. CV i %-коэффициент внутрииндивидуальной биологической вариации CV G %-коэффициент межиндивидуальной био- логической вариации CV i % CV G % Тромбоциты 9,1 21,9 АЧТВ 2,7 8,6 Протромбиновое время 4,0 6,8 Фибриноген 10,7 15,8 ATIII 5,2 15,3 Фактор YIII 4,8 19,1

Целевые значения В - целевое значение смещения средней ариф- метической от установленного значения,% CV -целевое значение коэффициента общей аналитической вариации,% + В% +CV% Тромбоциты 8,9 6,8 АЧТВ 3,4 2,2 ПВ 3,4 3,0 Фибриноген 7,2 8,0 ATIII 6,1 3,9 Фактор YIII 7,4 3,6

Предел допустимых значений +В 10 % +CV 10 % +В 20 % +CV 20 % Тромбо- циты 13,1 11,2 11,9 9,3 АЧТВ 4,8 3,7 4,4 3,1 ПВ 4,8 4,9 4,3 4,1 Фибрино- ген 12,2 13,1 10,7 11,0 ATIII 8,5 6,4 7,8 5,3 YIII ф. 9,6 5,9 9,0 4,9