Полимеразная цепная реакция Метод, который перевернул современную молекулярную биологию

История n Искусственный синтез ДНК с использованием праймеров был описан еще в 1971 г. Kleppe et al. n В 1983 г. Kary Mullis предложил метод, обеспечивающий накопление (амплификацию) синтезируемого фрагмента ДНК, получивший название полимеразная цепная реакция (Нобелевская премия по химии 1993 г). n Принцип реакции опубликован в 1985 г Science Dec 20;230(4732): Science Dec 20;230(4732):

Распространение метода ПЦР ГодЧисло публикаций

Основные достоинства ПЦР n Высокая чувствительность n Высокая специфичность n Проста в исполнении n Нет необходимости в выделении или сложной очистке матричной ДНК n Возможность работы с практически любым биологическим материалом

Значение для современной науки и медицины n Решение самых различных научных задач n Генотипирование организмов n Диагностика инфекционных заболеваний n Диагностика генетических заболеваний и генетической предрасположенности n Установление родства, идентификация личности n Анализ древних останков, криминалистика n Детекция ГМО

Репликация ДНК in vivo Матричная цепь Новая цепь

I. Разделение цепей (денатурация) 95° C

II. Отжиг праймеров III. Синтез ДНК (удлинение цепи) Праймер

Стадии ПЦР n Денатурация (94°C) –Обеспечивает разделение нитей ДНК n Гибридизация (отжиг) праймеров на матрице (45-65°C) –Формирует структуры узнаваемые ДНК- полимеразой n Синтез (удлинение) цепи (72°C) –Происходит синтез комплементарных цепей и удваивает число молекул ДНК мишени

Схема ПЦР Денатурация Отжиг праймеров Синтез 1 копия (матрица) 2 копии

Продукт ПЦР Денатурация Отжиг Синтез Продукты после 1-го цикла реакции Продукты после 2-го цикла реакции

Основные принципы ПЦР n Амплификация фрагмента происходит между двумя праймерами n Амплификацию проводят в течение циклов n Каждый цикл состоит из смены температурных режимов n В реакции используют термостабильные ДНК- полимеразы n За 30 циклов происходит умножение амплифицируемого фрагмента ДНК в раз n Кинетика ПЦР характеризуется выходом на «плато»

Основные причины выхода на «плато» n истощение субстратов (дНТФ и праймеров) n падение активности реактантов (дНТФ и фермента) n накопление ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы n конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами n концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Компоненты реакции n Буфер (Tris-HCl, pH = 8,0-8,8; KCl) n MgCl 2 (1-3 mM) n Праймеры (0.4 мкМ каждого) n dNTP ( мкМ каждого) n ДНК-полимераза (1 ед) n Матрица (1 до 1000 нг)

Ферменты Некоторые характеристики ДНК-полимераз Полимеразы Время полужизни при 95С (min) Экзонуклеазная активность 5'-3' (+/-) Экзонуклеазная активность 3'-5' (+/-) Достройка 3'- концов Taq40+-А-он Tth20+-A-он Pfu120-+blunt ends Vent400-+blunt ends Deep Vent1300-+blunt ends UlTma50-+blunt ends Pwo120 при 100С-+blunt ends

Праймеры n Длина праймеров нуклеотидов n GC-состав 45-55%, близок к GC-составу матрицы n Разница в температурах отжига не более 5 о С n Не должны формировать шпилек на 3-конце n Не должны формировать димеры по 3-концам

Оптимизация ПЦР n Температурный профиль реакции n Временной профиль реакции n Состав реакционной смеси конц. ионов магния конц. ионов магния конц. праймеров конц. полимеразы добавки (глицерин, ДМСО, формамид, БСА и др.)

Подбор температуры отжига Подбор концентрации ионов магния

10 причин, по которым ПЦР может не идти n Плохой дизайн праймеров n Неверная концентрация праймеров n Слишком много dNTP или деградированные dNTP n Не перемешанный раствор MgCl 2 n Неверная концентрация MgCl 2 n Наличие ингибиторов n Плохое качество минерального масла n Слишком много фермента n Ошибки в программе амплификатора n Недостаток или избыток матрицы

Оценка результатов реакции n Электрофорез n Гибридизация с зондами

Разновидности ПЦР n ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) n Touchdown n Мультиплексная n Гнездовая (nested) n In situ PCR n Reverse transcriptase (RT-PCR) n Real-time PCR (RT-PCR)

Другие методы амплификации n Лигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR) n NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)

Организация технологического процесса n Контаминация n Организация лаборатории (рабочих мест) по принципу изолированных рабочих зон n Раздельное использование оборудования и принадлежностей при работе с чистыми растворами и растворами, содержащими ДНК или продукты ПЦР n Обязательная постановка в каждом эксперименте отрицательного и положительного контролей n Стоковые растворы разделять на аликвоты и периодически заменять

Real-time PCR Интеркалирующие красители n SYBR green Гибридизационные зонды n Taqman n Molecular beacons n FRET probes