ВВЕДЕНИЕ В ОБМЕН ВЕЩЕСТВ БИОЭНЕРГЕТИКА Биоэнергетика, или биохимическая термодинамика, занимается изучением энергетических превращений, сопровождающих биохимические реакции. Ее основополагающие принципы позволяют объяснить, почему протекают одни реакции и невозможны другие. Небиологические системы могут совершать работу за счет тепловой энергии, биологические - за счет энергии химических процессов. В чем важность этой темы для медицины и фармацевтики? Вся необходимая энергия должна поступать в организм в виде топлива - питательных продуктов. Вопрос о том, как организм извлекает эту энергию - основа для понимания процессов нормального питания. Истощение энергетических ресурсов ведет к голодной смерти, запасание избыточной энергии в форме питательных веществ – к ожирению. Коррекция нарушений обменных процессов с помощью фармацевтических средств также должна учитывать энергетические потребности организма. Все химические реакции живой клетки подчиняются законам термодинамики. 1 закон : внутренняя энергия системы вместе с ее окружением остается постоянной, она лишь переходит из одной формы в другую. Самопроизвольно химические процессы могут протекать могут протекать только в одном направлении - к достижению равновесия, т.е. к максимальной энтропии. Энтропия - мера хаоса, неупорядоченности. 2 закон: энтропия при самопроизвольных процессах возрастает. Самопроизвольно разупорядоченная система никогда не превратиться в упорядоченную, для обращения надо затратить дополнительную энергию. Практически проще предсказать направление химических реакций с помощью свободной энергии системы, которую можно измерить. G = Н - T S G - это та часть энергии системы, которую можно использовать для совершения работы; Т S - связанная энергия, которая не может быть использована на работу; Н - энтальпия - внутренняя энергия системы (может быть измерена экспериментально ) Энергетическое состояние любой системы можно выразить, используя это выражение. если G < 0, то реакция экзергоническая, т.е. протекает самопроизвольно, с освобождением энергии (эти реакции поставляют клетке энергию); если G > 0, то реакция эндергоническая, т.е. идет с потреблением энергии; если G = 0 - это состояние равновесия.

Сопряжение эндергонических процессов с экзергоническими Жизненно важные процессы - реакции синтеза, мышечное сокращение, проведение нервного импульса, активный транспорт - получают энергию путем химического сопряжения с окислительными реакциями, т.е. происходит сопряжение экзергонических реакций с эндергоническими. Экзергоническими реакциям обычно являются катаболические реакции - распад или окисление топливных молекул (энергосодержащих нутриентов), которые поступают в составе пищевых продуктов. Эндергоническими являются реакции анаболизма - реакции синтеза сложных биоорганических соединений – клеточных макромолекул. Совокупность всех биохимических превращений химических веществ в живом организме представляет собой метаболизм. Катаболические пути освобождают свободную энергию в виде АТФ, НАДН, НАДФН и ФАДН 2. Эта энергия может быть использована в анаболических путях для превращения малых молекул в клеточные макромолекулы. Энергосодержащие нутриенты: углеводы липиды белки Энергетически бедные конечные продукты СО 2 Н 2 О NН 3 катаболизм анаболизм Клеточные макромолекулы: белки полисахариды липиды нуклеиновые кислоты Молекулы- предшественники: аминокислоты моносахара жирные кислоты азотистые основания химическая энергия

Главным макроэргом в живых организмах является аденозинтрифосфат (АТФ), который обеспечивает передачу свободной энергии от экзергоническим процессам к эндергоническим ( ~ ) означает, что перенос группы, соединенной такой связью, сопровождается выделением большого количества свободной энергии. Свободная энергия гидролиза концевой фосфатной группы АТФ = - 30,5 кДж/моль. Синтез АТФ из АДФ и фосфата (т.е. фосфорилирование АДФ) происходит в организме двумя путями, которые отличаются источником энергии для образования макроэргической связи : Для сопряжения этих процессов обычно необходим посредник, т.е. в процессе экзергонической реакции синтезируются соединения с высоким энергетическим потенциалом ~Е, которые в дальнейшем используются в эндергонических реакциях. Так передается химическая энергия от экзергонического к эндергоническому процессу. Вещества с высоким энергетическим потенциалом - макроэргические (~Е) - это биомолекулы, которые имеют высокую стандартную свободную энергию переноса концевой фосфатной группы. рибозааденин рибозааденин гидролиз АДФ АТФ Ф ~ G 0 АДФ + Ф АТФ энергия 1.Окислительное фосфорилирование (основной путь синтеза) – осуществляется за счет энергии окисления различных веществ (метаболитов или субстратов окисления). 2. Субстратное фосфорилирование - осуществляется за счет энергии разрыва макроэргических связей субстрата. Кроме АТФ, существуют и другие макроэрги - метаболиты углеводного, липидного и аминокислотного обменов, а также фосфагены (креатинфосфат), которые выступают в качестве резервуаров макроэргических связей: макроэрги: фосфоенолпируват - 61,9 кДж/моль карбамоилфосфат - 51, 4 кДж/моль 1,3-дифосфоглицерат - 49,3 кДж/моль креатинфосфат - 43,1 кДж/моль G 0

Важно понимать, что извлечь энергию можно не непосредственно из питательных веществ, поступающих с пищей, а из продуктов их распада, которые образуются в процессе обмена веществ. Обмен веществ в организме человека складывается из следующих последовательных стадий 1. Поступление питательных веществ - белков, жиров, углеводов, витаминов, минеральных веществ, воды - в составе продуктов питания. 2. Переваривание питательных веществ в ЖКТ до простых веществ, способных всасываться слизистой кишечника. 3. Биотранспорт продуктов переваривания кровью и лимфой, проникновение их через мембраны сосудов и клеток до определенных органов и тканей. 4. Внутриклеточный метаболизм (в узком смысле слова) - промежуточный обмен. 5. Выделение (секреция ) из организма концевых продуктов обмена веществ: углекислого газа, воды, мочевины и др. Итак, накопление энергии в специфических фосфатных связях АТФ лежит в основе механизма переноса энергии в живой клетке. Но живая клетка - неравновесная система, поэтому возможно и накопление химической энергии в макроэргических связях за счет извлечения ее из питательных веществ. Стадии катаболизма биомолекул 1 стадия (специфическая), подготовительная - макромолекулы углеводов, белков, липидов расщепляются до простых мономеров. Эта стадия гидролитическая, представляет собой переваривание в ЖКТ, реакции не сопровождаются существенным выделением энергии (всего до 1% энергии субстратов, которая выделяется в виде тепла). 2 стадия (специфическая) - ферментативные реакции расщепления веществ, образовавшихся в первой стадии, с образованием определенного количества энергии (до 20%), которая частично освобождается в виде тепла, а часть аккумулируется ~ связях АТФ. Реакции этой стадии происходят в анаэробных условиях внутри клеток (в цитоплазме и частично в митохондриях). Основными процессами этой стадии являются: для моносахаридов - гликолиз, в результате которого образуется пируват, а из него ацетил-КоА. для жирных кислот для жирных кислот - бета-окисление, конечным продуктом которого является ацетил~КоА для глицерина -превращение в пируват, а затем в ацетил~КоА для аминокислот и нуклеотидов - дезаминирование с выделением аммиака и превращением безазотистых углеродных скелетов в конечном счете в ацетил~КоА. Таким образом, ацетил~КоА - конечный продукт второй стадии катаболизма.

3 стадия (общая для всех обменов) - окисление ацетил~КоА до конечных метаболитов углекислого газа и воды. Эта стадия протекает в митохондриях - энергетических станциях клеток и состоит из двух процессов: цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), в результате которого образуется СО 2, а атомы водорода используются для восстановления коферментов НАД и ФАД. Водород - это универсальное энергетическое топливо, которое используется в дыхательной цепи для образования энергии и воды. системы электронного транспорта в мембранах митохондрий, в котором атомы водорода переносятся на кислород с образованием воды. Эта система сопряжена с окислительным фосфорилированием, в результате которого энергия биологического окисления используется для синтеза АТФ. ЛИПИДЫ УГЛЕВОДЫ БЕЛКИ аминокислотымоносахаридыглицерин жирные кислоты пируват ацетил-КоА NН3NН3 СО 2 ЦТК теплоАДФ + Ф АТФ О2 О2 Н 2 О СО 2 2Н + Дыхательная цепь митохондрий О2 О2

Пути потребления кислорода в реакциях биологического окисления Все многообразие реакций окисления, идущих с потреблением кислорода, можно свести к 4 основным типам. 1. Оксидазный путь (80-90% потребления кислорода) Продукты - окисленный субстрат, вода и энергия. Реализуется в митохондриях в дыхательной цепи. 2. Оксигеназный путь (8-12% потребления кислорода): - с помощью монооксигеназ: один атом кислорода включается в окисляемый субстрат, другой - в молекулу воды; - с помощью диоксигеназ:оба атома кислорода входят в окисляемый субстрат Цель этого свободного (т.е. несопряженного) окисления - превращение природных или неприродных субстратов (ксенобиотиков) в микросомах печени, коры надпочечников, поэтому называется микросомальным окислением. Таким путем холестерин окисляется в стероидные гормоны и желчные кислоты, тирозин - в меланины. Этим же путем обезвреживаются в печени токсичные метаболиты и ксенобиотики - лекарственные препараты или яды. Микросомальные цепи представляют собой короткие цепи переноса протонов и электронов, источником которого служит НАДФН. а активатором кислорода - цитохром Р-450: 3. Пероксидазный путь - с образованием перекиси водорода с помощью пероксидобразующих ферментов - флавопротеинов Таким путем окисляются аминокислоты, биогенные амины и др. Образование токсичного пероксида является издержкой, однако, в фагоцитирующих клетках (например, лейкоцитах) пероксид служит для обезвреживания патогенных бактерий. 4. Свободнорадикальное окисление происходит под действием активных форм кислорода (АФК), которые образуются при одноэлектронном восстановлении кислорода: -супероксид-анион -перекись водорода -гидроксильный радикал -синглетный кислород АФК - очень реакционноспособные молекулы, которые спонтанно ускоряют цепные реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительно модифицируют другие биомолекулы - белки, нуклеиновые кислоты и др. Эти процессы потребления кислорода активно протекают в мембранах, где имеются ненасыщенные жирные кислоты в составе фосфолипидов. Цель этого процесса - обновление мембран и регуляция их проницаемости. Супероксиданион активирует образование в тканях NО-радикала, который способствует вазодилатации, а также, превращается в пероксинитрит ОNООН, который индуцирует апоптоз - запрограммированную смерть клеток. Антиоксиданты, например, витамин Е - токоферол - способны улавливать свободные радикалы, снижая тем самым токсичность кислорода.

Биологическое окисление, сопровождающееся потреблением кислорода и образованием энергии и воды, называется тканевым дыханием. Это многостадийный процесс переноса водородов (протонов и электронов) от субстратов окисления через ряд промежуточных переносчиков к кислороду с образованием воды и выделением энергии. Субстраты окисления образуются в ходе катаболизма белков, жиров и углеводов. Это вещества, которые подвергаются дегидрированию, т.е. отщеплению атомов водорода. Водород - универсальное энергетическое топливо, которое используется в тканевом дыхании для образования энергии и воды. Тканевое дыхание представлено полиферментной цепью переноса электронов и протонов (ЦПЭ), которая называется дыхательной митохондриальной цепью или дыхательным ансамблем. Она имеет структурную организацию, т.к. ее компоненты встроены во внутреннюю мембрану митохондрий (от 5 до 20 тыс. ансаблей в одной митохондрии). Биологическое окисление Промежуточные переносчики (Р) при транспорте электронов от исходного донора электронов (субстрата) к терминальному акцептору – кислороду Полный процесс представляет собой цепь последовательных окислительно- восстановительных реакций, в ходе которых происходит взаимодействие между переносчиками. Каждый промежуточный переносчик (P) вначале выступает в роли акцептора электронов и протонов и из окисленного состояния переходит в восстановленную форму. Затем он передает электрон следующему переносчику и снова возвращается в окисленное состояние. На последней стадии переносчик передает электроны кислороду, который затем, присоединяя протоны, восстанавливается до воды. Н 2 О 1/2О 2 S SH2SH2 SH2SH2 О2 О2 SH2SH2 Н2Н2

3. Убихинон - КоQ 2. Флавиновые дегидрогеназы или флавопротеины (ФП) Сложные ферменты, простетическими группами которых является ФМН или ФАД (активные формы витамина В 2 ). 1. НАД-зависимые дегидрогеназы Небольшая молекула, растворимая в липидной части мемебраны (благодаря неполярной боковой цепи), поэтому она легко перемещается в толще мембраны. Название «убихинон» возникло из-за его повсеместной распространенности в природе. Кофермент Q является своеобразным коллектором протонов и электронов 2Н + 2е - от восстановленных коферментов ФМНН 2 и ФАДН 2 переходя при этом в восстановленную форму КоQН 2. ФМН НАД + (окисленная форма) + НАДН (восстановленная форма ) 2Н + 2е - Н+Н+ Н.. Сложные ферменты, которые катализирует реакции окисления непосредственно субстратов (первичные дегидрогеназы). НАД + - (активная форма витамина РР) - кофермент этих ферментов, акцептируя два протона и два электрона (2Н + 2е - ) от S превращается в восстановленную форму НАДН. S ФАД ФМН Н Н 2Н + 2е - ФАДН 2 (ФМНН 2 ) (восстановленные) Дегидрогеназы, содержащие ФАД, катализируют окисление некоторых субстратов, например, янтарной кислоты (сукцината), т.е. это первичные дегидрогеназы (сукцинатдегидрогеназа). Дегидрогеназа, содержащая ФМН, акцептирует протоны и электроны от восстановленных коферментов НАДН, т.е. это НАДН-дегидрогеназа. 2Н + 2е - ОНОН ОНОН ФАД, (ФМН) (окисленные) КоQ (окисленный) КоQН 2 (восстановленный)

4. Железо-серные белки Это сложные белки, содержащие негеминовое железо и серу, которые могут обратимо окисляться и восстанавливаться, т.е. переносить электроны. Расположены в липидном слое мембраны Эти окислительно-восстановительные системы стабильны только в составе молекул белков. Они могут содержать от 2 до 6 ионов железа, образующих комплексы различного состава с неорганическим сульфидом и SH-группами остатков цистеина белка. Все участники цепи переноса электронов структурно объединены в четыре окислительно-восстановительные системы – мультиферментные комплексы (I - IV), встроенные в липидный матрикс внутренних мембран митохондрий. Процесс окисления начинается с переноса протонов и электронов 2Н + 2е - с окисляемого субстрата на НАД + или ФАД (это зависит от природы субстрата). белок 5. Цитохромы белок гем С Это сложные белки – гемопротеины, содержащие гем (подобные гему гемоглобина) - прочно связанную простетическую группу. Гем содержит геминовое железо, способное менять валентность, т.е. переносить только электроны. Цитохромы отличаются друг от друга как белковым компонентом, так и заместителями в геме, следовательно, физико-химическими свойствами, т.е. окислительно- восстановительными потенциалами. Цитохром аа 3 - цитохромоксидаза - терминальный фермент, который переносит электроны непосредственно на кислород (аэробный фермент), состоит из 6 субъединиц, кроме геминового железа содержит ионы меди, переносящий электроны. В переносе электронов участвуют сначала ионы железа цитохромов а и а 3, а затем ион меди цитохрома а 3. В дыхательной цепи цитохромы служат переносчиками электронов и располагаются соответственно величине окислительно-восстановительного потенциала следующим образом: цит.b, цит.с 1, цит.с, цит.а, а 3. Молекулярная организация цепи переноса электронов SH2SH2

Комплекс I – НАДН-дегидрогеназа – флавопротеин, содержащий ФМН. Этот фермент окисляет НАДН и передает два водорода (2Н + 2е - ) на коэнзим Q. В комплекс входят также Fe-S-белки. Комплекс III – убихинондегидрогеназа – ферментный комплекс, состоящий из цитохрома b, Fe-S-белка и цитохрома с 1. Этот комплекс транспортирует электроны 2е - от восстановленного убихинона КоQН 2 на цитохром с (небольшой по размерам водорастворимый белок, находится на внешней стороне внутренней мембраны). НАДН НАД + сукцинат ацил-КоА мембрана Глицерол-3-фосфат матрикс митохондрии SH 2 изоцитрат пируват малат глутамат и др. В матриксе митохондрий находятся также другие ФАД-зависимые дегидрогеназы, которые окисляют соответствующие субстраты (глицерол-3-фосфат, ацил-КоА) и передают далее водороды на коэнзим Q. Комплекс II – сукцинатдегидрогеназа – флавопротеин, содержащий ФАД. Этот фермент окисляет сукцинат и передает два водорода (2Н+2е - ) на коэнзим Q. В составе комплекса есть Fe-S-белки. Коэнзим Q является последним компонентом цепи, который способен транспортировать как протоны, так и электроны (2Н + 2е - ). Далее протоны (2Н + ) переходят с внутренней поверхности мембраны митохондрий на внешнюю, а электроны е - через цепь цитохромов переносятся на кислород. Комплекс IV – цитохром с-оксидаза – ферментный комплекс, состоящий из цитохромов а и а 3. Эти ферменты осуществляют последнюю стадию биологического окисления – восстановление электронами 2е - молекулярного кислорода: 2е + ½ О 2 О 2- Восстановленный кислород О 2- взаимодействует со свободными протонами 2Н + матрикса, в результате чего образуется вода: 2Н + + О 2- Н 2 О Потоки атомов водорода сливаются на стадии образования восстановленного КоQН 2. матрикс митохондрии фумарат сукцинат НАДНН НАД + ½ О 2 +2Н Н 2 О матрикс Межмембранное пространство

Редокс-потенциал пары НАД + /НАДН = -0,32 в, что говорит о высокой способности отдавать электроны. Редокс потенциал пары кислород/вода = +0,82 в, что говорит о высоком сродстве к электронам. При прохождении по ЦПЭ пары электронов выделяется энергия, большая часть которой (60%) рассеивается в виде тепла, а остальная аккумулируется в макроэргических связях АТФ, т.е. поглощается в ходе реакции синтеза АТФ, т.е. окислительного фосфорилирования. Направление переноса протонов и электронов определяют окислительно- восстановительные потенциалы. Для обеспечения спонтанного переноса члены окислительно-восстановительного ряда должны располагаться в порядке возрастания потенциалов. теплоАДФ + Ф АТФ О2 О2 Н 2 О Дыхательная цепь митохондрий энергия -0,32 +0,82 Общая разность редокс-потенциалов равна 1,14 в, этому соответствует изменение свободной энергии G = -220 кДж/моль. Эта общая величина энергии реакции разбивается на небольшие и более удобные «пакеты», величина которых определяется разностью окислительно- восстановительных потенциалов соответствующих промежуточных продуктов. Предполагается, что это разделение на пакеты обеспечивает дыхательной цепи удивительно высокий выход энергии, составляющий примерно 60%. Комплекс I ФМН FeS Комплекс III b FeS c 1 Комплекс IV a a 3 с Q SH2SH2 НАД + ФАД FeS Комплекс II SH2SH2 1/2О 2 Н2ОН2О 2Н

Это фосфорилирование называется окислительным, т.к. энергия для образования макроэргической связи генерируется в процессе окисления, т.е. движения протонов и электронов по ЦПЭ. Основные переносчики электронов – комплексы I, III, IV – используя энергию электронов, обеспечивают перенос протонов Н + из матрикса в межмембранное пространство. В результате понижается значение рН и возникает протонный электрохимический потенциал Н + (хемиосмотическая теория П.Митчелла). Именно этот потенциал является движущей силой синтеза АТФ из АДФ и Ф. Синтез АТФ сопряжен с обратным потоком протонов Н + из межмембранного пространства в матрикс. Внутренняя мембрана митохондрий для этого потока непроницаема. Осуществляется обратный поток протонов благодаря специальной ферментной системе, называемой протонная АТФ-аза или АТФ-синтетаза (комплекс V). При достижении определенного значения Н + активируется АТФ-аза, в ней открывается канал, через который протоны возвращаются в матрикс из межмембранного пространства, а энергия Н + используется для синтеза АТФ. матрикс Межмембранное пространство НАДНН НАД + сукцинат фумарат синтез АТФ химический потенциал рН Электрохимический потенциал Н + ½ О 2 +2Н + Н 2 О АДФ+Ф АТФ-синтетаза V Механизм окислительного фосфорилирования

Субстраты SH 2, окисляемые НАД-зависимыми дегидрогеназами (пируват, -кетоглутарат, изоцитрат, малат, глутамат, лактат) являются более энергетически ценными, т.к. при их окислении образуется 3 АТФ (P/O = 3), чем субстраты, окисляемые ФАД-зависимыми дегидрогеназами (сукцинат, ацил-КоА, глицерол-3-фосфат), при окислении которых образуется 2 моля АТФ (P/O=2). Каждый из трех комплексов (I, III, IV) обеспечивает протонный градиент, необходимый для активации АТФ-синтетазы и синтеза 1 молекулы АТФ. НАД + SH 2 (P/O = 3) пируват -кетоглутарат изоцитрат малат глутамат лактат SH 2 (P/O=2) сукцинат ацил-КоА глицерол-3-фосфат О2О2 Комплекс I ФМН FeS Комплекс III b FeS c 1 Комплекс IV a a 3 с Q АДФ + Ф АТ Ф АДФ + Ф АТ Ф АДФ + Ф АТ Ф ФАД FeS Коэффициент окислительного фосфорилирования P/O – отношение количества фосфорной кислоты (Р), использованной на фосфорилирование, к поглощенному кислороду (О). P/O зависит от точки вхождения восстановительных эквивалентов H 2 от субстратов SH 2 в цепь транспорта электронов. Процессы усвоения пищи и образования АТФ должны приспосабливаться к энергетическим потребностям клетки, т.е. производство и потребление АТФ должно быть согласовано. При увеличении в клетке расходования АТФ повышается скорость поступления АДФ в митохондрии, а значит, растет скорость синтеза АТФ. Поэтому увеличивается скорость переноса протонов, т.е. возрастает скорость дыхания. Такая корреляция, т.е. ускорение окислительного фосфорилирования и дыхания при повышении концентрации АТФ называется дыхательным контролем. Другими словами, дыхательный контроль – это соотношение АТФ/АДФ: при его понижении интенсивность дыхания увеличивается. Все описанные процессы переноса протонов и электронов и синтеза АТФ (тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования) тесно сопряжены: они происходят только одновременно и скорость их меняется одновременно.

1. Ингибиторы, блокирующие дыхательную цепь за счет связывания с определенными ферментами или коферментами на разных участках цепи. При этом Р/О снижается до нуля в зависимости от места действия ингибитора: а) ротенон (инсектицид), барбитураты (снотворные), антибиотик пиерицидин А. б) антимицин (антибиотик). в) CN -,CO,H 2 S. В некоторых случаях сопряжение фосфорилирования и дыхания нарушается, т.е. происходит «неконтролируемое» дыхание митохондрий. Это может происходить при повреждении мембраны митохондрий, а также при действии веществ, функционально разделяющих окисление и фосфорилирование – разобщающих агентов. Эти липофильные вещества (2,4-динитрофенол, жирные кислоты) могут переносить протоны через мембрану митохондрий, минуя АТФ-азу, т.е. уничтожая протонный градиент. Природный разобщающий агент – белок термогенин, который является протонным каналом в митохондриях бурого жира. При этом Р/О снижается, энергия рассеивается в виде тепла. Ингибиторы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования Ротенон, барбитураты антимицин СN - или СО 2. Ингибиторы окислительного фосфорилирования: а) олигомицин – антибиотик, ингибирует функцию АТФ-синтетазы (не действует на тканевое дыхание). а) в) с)