Башкирский государственный педагогический университет им. М.Акмуллы К ВОПРОСУ О ВЫДЕЛЕНИИ И КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВОДОРОСЛЕЙ И ЦИАНОБАКТЕРИЙ Выполнил:Каназырская В.Ю. Научный руководитель:Суханова Н.В.

Актуальность Для решения вопросов изучения биоразнообразия микрофототрофов, их морфологии, физиологии, перспектив использования в биотехнологии, важно создавать и поддерживать коллекцию культур водорослей и цианобактерий. Такая коллекция создана в Лаборатории экологии почвенных водорослей им. Л.Хайбуллиной на кафедре ботаники, биоэкологии и ландшафтного проектирования БГПУ им. М.Акмуллы.

Цель работы Целью нашей работы являлся подбор методов выделения и культивирования водорослей для пополнения коллекции микроводорослей и цианобактерий, а также поддержание ее хорошем состоянии. Решаемые нами задачи: 1) изучение данных литературы об основных методах выделения и культивирования водорослей, 2) проведение сравнительной характеристики питательных сред для культивирования водорослей и цианобактерий.

Факторы влияющие на выделение водорослей Для морских водорослей - температура и соленость воды; Для океанского фитопланктона, важны качество воды и токсичность металлов; Для диатомовых водорослей необходим кремний, эвгленовых - аммоний,некоторые виды нуждаются в селене; Миксотрофные виды нуждаются в добавлении источников питания для бактерий, бесцветные фаготрофы могут требовать эукариотических источников питания; Уничтожение загрязнителей, особенно тех которые могут конкурировать с нужным видом;

Оборудование и материалы Бинокулярная лупа, микроскоп; Фильтры и сита; Стеклянные и пластиковые чашки Петри; Микропипетка с дозатором; Петля и пинцет; Пипетка Пастера; Стеклянная трубочка, маленький шланг и соединительная трубка; Мундштук и два наконечника пластиковых пипеток; Стеклянная планшета; Стерильные колбы для культивирования с крышками;

Выделение клеток с помощью микропипетки Самый распространённый метод выделения водорослей. В этом методе используется микропипетка Пастера нагревают в пламени спиртовки. Когда нагреваемый участок расплавится, пипетку двигают в пламени и постепенно вытягивают для получения тонкой трубочки. Изогнутый кончик удобен для того, чтобы достать водоросли из глубокой ёмкости, но прямой наконечник удобен для того, чтобы поместить водоросль в каплю воды. После вытягивания кончика пипетки его следует остудить в течение пары секунд. Затем пинцетом нужно найти участок в самом тонком месте, лучше всего перед изгибом вниз. Затем лёгким движением нужно сломать пипетку и отломанный конец выбросить..

Первый метод для захвата отдельных клеток с помощью микропипетки Суть первого метода заключается в следующем. Гибкий резиновый шланг нужно соединить с мундштуком и с микропипеткой. Короткий конец шланга, соединенный с соединительной трубкой, обеспечивает быстрое и лёгкое крепление с микропипеткой. Исследователь помещает небольшое количество стерильной воды в микропипетку. Затем нужно поместить конец микропипетки рядом с нужной водорослью и втянуть каплю ртом для того, чтобы водоросль попала в микропипетку. После успешного захвата нужной клетки, конец пипетки нужно переместить в стерильную каплю, затем в следующую каплю и т.д. Эти операции нужно выполнять с осторожностью, чтобы не повредить клетку.

Второй метод для захвата отдельных клеток с помощью микропипетки Согласно другой методике конец микропипетки может быть помещен в стерильную каплю таким образом, что в результате капиллярной силы вода попадет в микропипетку. Если сухую пипетку погрузить в образец, то в результате капиллярной силы в пипетку могут попасть нежелательные частицы. После погружения в стерильную жидкость микропипетку подводят к выбранной клетке, и остаточная капиллярная сила засосет клетку в микропипетку. Затем конец микропипетки с нужной клеткой нужно перенести в следующую стерильную каплю, и клетку можно освободить путем выдувания. Иногда стерильная капля, наряду с нужной клеткой водоросли, может содержать и другие частицы, используя этот метод, можно перенести нужную клетку в следующую стерильную каплю. Эту процедуру можно повторять до тех пор, пока исследователь полностью не очистит клетку, которую затем можно поместить в ёмкость с питательной средой.

Выделение клеток с использованием агара 1. Культивирование водорослей внутри агара; 2. Методика автоматизированного распыления; 3. Выделение водорослей методом перемещения через агар; 4. Метод разбавления

Культивирование водорослей внутри агара Некоторые водоросли не растут на поверхности агара, но очень хорошо растут внутри него. Для получения погруженных в агар колоний клетки из полевого образца или обогащенной культуры смешивают с жидким агаром и потом разливают в чашки Петри. Агар должен быть прохладным –чуть выше температуры застывания – для предотвращения чрезмерного нагревания водорослей. Для этих целей лучше использовать агар с низкой температурой застывания.После этого чашки нужно остудить. Затем колонии нужно инкубировать при нужной температуре и освещенности до появления колоний водорослей. Потом можно выделить нужные водоросли с помощью микропипетки и поместить в жидкую питательную среду.

Методика автоматизированного распыления Этот способ может использоваться для посева водорослей в чашки Петри. Методика может варьировать, однако суть метода состоит в распылении суспензии клеток водорослей с помощью специальных устройств. Для достижения лучших результатов эту процедуру лучше проводить стерильном боксе, чтобы бактерии и грибы не попали в чашку. После инкубирования клеток выросшие колонии водорослей переносят в жидкую питательную среду.

Выделение водорослей методом перемещения через агар Агаровые чашки могут быть использованы для отделения нитчатых водорослей от эпифитов в качестве одного из этапов процесса выделения. Существует много различных вариаций этой методики. Обычно при использовании данного метода исследователи изготавливают из пипетки Пастера крючок, и с помощью этого крючка протаскивают нить через агар. Для более крупных нитей используется металлический крючок. Затем очищенная нить помещается в жидкую питательную среду или в чашку с агаром.

Метод разбавления Целью метода разбавления является помещение клеток в пробирку, колбу или «гнездо» пластиковой планшеты с последующим получением одноклеточных изолятов. Если знать приблизительную концентрацию клеток, то можно легко вычислить необходимое разведение, чтобы небольшой объем раствора содержал одну клетку. Если приблизительная концентрация клеток неизвестна и не может быть быстро вычислена, то можно приготовить серию разбавленных растворов, уменьшая концентрацию от разведения к разведению в 10 раз. В большинстве случаев пятое или шестое разведение имеет необходимую концентрацию клеток ( так, например, если в шестом разведении одна капля содержит одну клетку, то концентрация в первоначальном растворе была

Различные варианты этой методики Во-первых, разведение может проводиться в питательной среде, дистиллированной воде (для пресноводных организмов), морской воде( для морских организмов), отфильтрованной воде из полевого образца, или комбинации из этих растворов. Во-вторых, усилия исследователей могут быть направлены, на концентрации, при которых возможно выделение отдельных клеток(10,50,100 попыток). Обычно делают большое количество пробирок из последнего разведения, принимая во внимание, что в некоторых пробирках клетки могут погибнуть, другие могут содержать несколько видов, а в следующих водоросли вообще могут отсутствовать. В-третьих, в некоторые пробирки могут быть добавлены микроэлементы ( например, аммоний, селен), если целью является выделение видов, которые нуждаются в этих добавках. Таким же образом можно инкубировать водоросли при разной температуре и освещенности. При помощи этой методики редко удается получить аксеничные культуры, так как бактерии более многочисленны, чем водоросли.

Общие методы приготовления питательных сред Питательные среды для культивирования водорослей можно разделить на три группы: синтетические; обогащенные; почвенные вытяжки;

Синтетические (искусственные) среды Они были созданы прежде всего для того, чтобы обеспечить культивирование водорослей как для экспериментальных исследований, так и для поддержания жизнеспособности штаммов. В качестве примеров можно привести среды: Болда, Чу-10, BG-11, WC. Эти среды могут быть как жидкими, так и агаризованными. При использовании питательных сред следует помнить, что дистиллированная и деионизированная вода, а также ультрачистые химикаты могут содержать следовые количества посторонних примесей, измеряемых нанограммами или пикограммами.

Обогащенные среды Они готовятся путем добавления питательных веществ к естественной озерной или проточной воде или обогащением синтетической среды раствором почвенной вытяжки, растительных экстрактов (например, торфяного мха), экстракта дрожжей и т.д. Природная вода должна быть относительно чистой и не иметь загрязнения. Если природная вода содержит значительное количество органических примесей, это может вызвать интерференцию в молекулярно-биологических исследованиях, особенно когда нуклеиновые кислоты выделяются без промывания клеток. В качестве примера обогащенной среды можно привести среду Algo-Gro (Carolina Biological Supply Co.), среду для выращивания Audouinella, среды для диатомовых водорослей, среду VS, модифицированную среду для Porhyridium, среду Малта, среду для Poly-toma (Andersen et al., 2005).

Почвенная вытяжка Почвенную вытяжку готовят добавлением 1-2см высушенной и просеянной садовой почвы на дно склянки с водой. Вытяжка подобна озеру или пруду, где питательные вещества постоянно циркулируют из донных отложений в верхние слои воды благодаря жизнедеятельности бактерий и перемешиванию воды. В почвенной вытяжке диффузия, также как и биохимическая активность бактерий (ксеничные культуры) и водорослей на границе почвы и воды, имитируют естественные условия. Состав почвенной вытяжки зависит от почвы (например, рН, питательные вещества, органические буферы, витамины), и поэтому очень важно найти хорошую и в то же время соответствующую почву. Водоросли, растущие на почвенной вытяжке, обычно имеют нормальную морфологию, и эти культуры можно поддерживать длительное время.

Материалы и методы работы Для сравнительного анализа питательных сред нами были выбраны: среда 3NNB, среда Данилова, среда Бристоль, среда Громова, среда Кнопа, среда Прата, среда Z-8. Каждую культуру выращивали в 50 мл анализируемой среды (состав приведен в табл. 1) в течение одного месяца на люминостате при температуре +240С. Колбы с культурами ежедневно встряхивали. Плотность культуры оценивали путем измерения оптической плотности на спектрофотометре ПЭ-5400УФ. Для каждой среды была вычислена длина волны, проводились в кюветах в 5 мл.

Объекты исследования Для эксперимента были отобраны из коллекции штаммы следующих видов: 1)Scotiellopsis rubescens S8, 2)Interfilum terricola S11-2, 3)Elliptochloris cf. subsphaerica S11-11, 4)Nostoc sp. S11-17, 5)Pseudophormidium hollerbachianum S1. Эти виды были выделены из микробиотичеких корочек, степной зоны РБ, в окрестностях г.Сибай.

Scotiellopsis rubescens S8 Клетки одиночные, молодые - веретеновидные до лимоновидных, заостренные на полюсах, зрелые – от широкоэллипсоидных до шаровидных, чаще без полярных утолщений, от 8 до 15, иногда до 18 мкм дл., 7,5-12 мкм шир.

Interfilum terricola S11-2 Клетки, эллипсоидные до округлого, чаще всего одиночные, двойные либо часто выстраиваются в нити (до 12 клеток), окружены тонкой гелеобразной слизью. Хлоропласт блюдцевидный. Каждая клетка выстлана хлоропластом на половину, с одним переноидом. Клетки (4,5)-6-10 мкм дл., 4,5-7(8,5) мкм шир., слизь составляет 2-3 мкм толщиной.

Elliptochloris cf. subsphaerica S11-11 Клетки цилиндрические, удлиненно-эллипсоидные, молодые -5-8 мкм дл., 2,5-3,5 мкм шир., зрелые -10 мкм дл., 7 мкм шир.,или почти шаровидные и шаровидные, от 5 до 17 мкм в диам. Оболочка всегда тонкая. Хлоропласт молодых клеток лентовидный или блюдцевидный с ровным краем, выстилающий не более половины клетки, в зрелых клетках с волнистым, неправильно-лопастным краем, выстилающий более половины клетки.

Nostoc sp. S11-17 Слоевища микро - или макроскопические, аморфной или сферической формы. Оболочки вокруг трихомы присутствуют, но видно их обычно только на периферии колонии или в молодых колониях, сливающиеся с колониальной слизью, иногда желтовато- коричневого цвета. Носток имеет особый жизненный цикл, в течение которого образуются несколько специальных и характерных этапов

Pseudophormidium hollerbachianum S1. Нити одиночные, объединены в микро- или макроскопические слои. Трихомы как правило, короткие, неправильно изогнутые и спиральные, 1-18 мкм шириной, однорядные, состоящие из бочкообразных или цилиндрических клеток, суженные на стенках, неподвижны. Клетки чуть длиннее, чем в ширину,, но обычно нерегулярно гранулированные или с несколькими видными гранул, сине- зеленый, серо сине-зеленые или розоватые, конец клетки округлый или коническо-округлые, иногда с утолщенной наружной стенкой клетки

Результаты. Для каждой среды изначально была вычислена необходимая длина волны. Для среды Z- 8 она составляла 315нм, для среды 3NNB и Бристоль – 750нм, для сред Прата, Кнопа, Громова и Данилова составляла 590нм. Далее была измерена оптическая плотность при данной для этой среды длине волны для каждого вида, культивируемой водоросли. Результаты представлены на графике

Значения оптической плотности культур водорослей

Наибольшее значение оптической плотности для штамма Nostoc sp. S11-17 при культивировании на среде Данилова и Громова; для штамма Scotiellopsis rubescens S8 - на среде 3NNB и Бристоль, для штамма Pseudophormidium hollerbachianum S1 - на среде Кнопа, Interfilum terricola S на среде Бристоль, Elliptochloris cf.subsphaerica S на среде Кнопа.

В среднем самое высокое значение плотности культур для всех видов водорослей было установлено при выращивании их на среде Бристоль.

Заключение. Довольно широкий разброс значений оптической плотности, скорее всего, связан с индивидуальными особенностями каждого штамма водорослей и цианобактерий. Подбор среды для культивирования водорослей необходимо проводить с учетом физиологических и биохимических особенностей каждого вида или отдела.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!