Методы очистки белков. §Методы осаждения белков (суть состоит в том, что агент разрушает гидратную оболочку белка. Падает его растворимость в воде и он при разной концентрации осадителя выпадает в осадок: §высаливание (NH4)2SO4; §осаждение ацетоном; §осаждение спиртами. §Хроматографические методы: ионообменная хроматография. разделение белков по массе. афинная хроматография.

Электрофорез.

Ферменты. Ферменты белковые молекулы, способные ускорять протекание биохимических реакций. Кроме ферментов- белков существуют так называемые рибозимы РНК, способные осуществлять катализ.

§Ферменты работают при температуре от 0 до 37 С, рН=6- 8, присутствие в клетке соединений, давлении 1 атмосфера. §Активный центр это участок фермента на котором происходит связывание и превращение молекулы субстрата. §E - фермент §P - продукт §S – субстрат §I - ингибитор §[ES] – фермент-субстратный §комплекс §v – скорость работы §Vmax – максимальная скорость

Коферменты и кофакторы. §Большинство ферментов имеют в своем составе вещества не белковой природы, необходимые для протекания реакции, такие вещества называются кофакторами. Наиболее часто ими являются ионы металлов. §Если в состав фермента входит группа органической природы, то это кофермент. Чаще всего кофермент производное витаминов. §NAD+, NADF+ производное никотиновой кислоты. §FAD, FMN рибофлавин В2. §Коферменты связаня ковалентно или образовывают нестабильные комплексы. Кофермент, связанный ковалентно называется простетической группой. §Апофермент белковая часть фермента. §Холофермент = апофермент + кофермент (кофактор)

Единицы измерения активности §Активность фермента количество превращенного вещества в единицу времени. §1 катал = 1 моль/сек. §ФЕ – ферментативная единица. §За ФЕ принимают количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата или образование 1 мкмоль продукта за 1 минуту при температуре 25 С. §Удельная активность соотношение активности фермента на мг белка. §По скорости работы бывают относительно быстрые и относительно медленные ферменты. Характеризуются числом оборотов количество молекул субстрата, превращенного 1 молекулой фермента за 1 сек. Самым активным считается карбоангидраза 10 6 об/сек. Для большинства – 100 об/сек. Есть ферментные комплексы, которые катализируют не более 1 об/сек.(нитратредуктаза).

Специфичность ферментов. §высокоспецифичные; §низкоспецифичные; §неспецифичные. §Большинство ферментов высокоспецифичные, т.к. превращают 1 какой-то субстрат. Низкоспецифичные работают с группой сходных веществ (трипсин, хемотрипсин). Неспецифичные (эндонуклеаза).

Наименование и классификация ферментов §Наименование фермента состоит из субстрата + процесс + -аза. §КФ алкогольдегидрогеназа §Все ферменты по механизму их действия делятся на 6 классов: §I. Оксидоредуктазы. Это ферменты, катализирующие реакции, связанные с переносом электронов, т.е. окислительно-восстановительные реакции. В качестве коферментов используют NAD+, NADF+, FAD, FMN. В качестве простетической группы может использоваться гем и FeS-кластеры. §Никотинамид (NADР+ и NAD+) производное никотиновой кислоты, а она является витамином РР. §FAD и FMN являются производными рибофлавина или витамина В2.

§II. Трансферазы. §а) п/кл фосфотрансферазы. §Все трансферазы переносят функционольные группы. Фосфотрансферазы катализируют перенос фосфатной группы. Коферментом является АТФ. В этой молекуле остатки фосфорной кислоты связаны между собой макроэргической связью. Кроме АТФ могут учавствовать молекулы ЦТФ, ГТФ, УТФ. §б) п/кл аминотрансферазы. §Ферменты отвечают за перенос аминогрупп. §Коферментом является передоксильфосфат, является производным пиридоксина витамина В6. §в) п/кл ацилтрансферазы. §Переносят остатки органических кислот. Коферментом является кофермент А, производное пантотеновой кислоты. §г) п/кл переносящие одноуглеродные группы(СН, СН3). §Коферментом является тетрагидрофолиевая кислота, производная витамина фолиевая кислота.

§III. Гидролазы. §Ферменты, катализирующие расщепление веществ с участием воды. Они не нуждаются в коферментах. §IV. Лиазы. §Ферменты, катализирующие присоединение веществ по двойным связям. §V. Изомеразы. §Катализируют внутримолекулярные перегруппировки. Имеют окончание –изомераза или –мутаза. Могут осуществлять рацимизацию, транс-,цисизомеризацию, внутримолекулярный перенос функциональных групп. Коферментом является цианкобаламин производное витамина В12. §VI. Лигазы = синтетазы. §Ферменты, осуществляющие энергозависимый синтез. Поставщиком обычно является внутриклеточный пирофосфат(АТФ, АДФ).

Механизм действия ферментов §Биологический ферментативный катализ является примером каталитического процесса и для него выполняются все законы. §Классические катализаторы действуют за счет энергии активации. Энергия активации энергия, необходимая молекуле вещества для преодоления энергетического барьера. Катализаторы не меняют G они снижают энергию активации. Снижение энергии активации увеличивает количество молекул, способных преодолеть энергетический барьер реакции и происходит это не линейно, не пропорционально.

Снижение энергии активации достигается за счет: §1. ориентации субстратов. §2. Теория стерического взаимодействия (взаимодействие ключ-замок). Фишер предположил, что активный центр фермента пространственно соответствует молекуле субстрата. За счет своей пространственной специфичности фермент и субстрат ориентируются специфично.

§3. теория индуцированного соответствия. §Предложил Кошланд. После образования комплекса фермент- субстрат, в молекуле фермента могут наблюдаться некие конформационные изменения, которые индуцируют соответствующие изменения в молекуле субстрата.

§4. образование промежуточных комплексов. §а) кислотно-основный катализ. §В ферменте донорами протонов могут являться аминокислотные остатки цистеина, глутамата, аспартата, лизина, гистедина. Акцепторами протонов являются те же самые группы но в депротонированной форме. §б) ковалентный катализ. §При нем субстрат или его часть образуют устойчивые ковалентные связи с молекулой фермента. §в) нуклеофильная-электрофильная атака

Факторы, влияющие на активность фермента §Концентрация субстрата. §В 1913г. Михаэлис и Ментен проедложили уравнение § = max [S]/Km+[S] §Km - константа Михаэлиса. §Лимитирующим фактором протекания реакции, является образование фермент-субстратного комплекса. §Km= концентрации субстрата при которой скорость реакции равна ½ скорости максимальной. §Т.к. это концентрация, то она выражается моль/литр и тп. §Уравнение Михаэлиса-Ментен описявает односубстратные не аллостерические ферменты.