С. Кузнецов Научный руководитель канд. биол. наук М. Турчанинова Применение молекулярных биконов для визуализации мРНК в живых клетках Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Цель работы Оценить перспективы использования технологии молекулярных биконов для визуализации мРНК в живых клетках Задачи 1) Выбрать гены-мишени для гибридизации с молекулярными биконами 2) Подобрать наиболее эффективную схему эксперимента 3) Сравнить результаты метода визуализации мРНК в живых клетках с помощью молекулярных биконов с другими референсными методиками определения активности генов

Что такое биконы? Биконы – это короткие синтетические олигонуклеотиды, состоящие из двух частей: петли и стебля Принципиальным моментом является наличие флюоресцентной краски и её гасителя

Принцип работы биконов Бикон, специфичный мРНК определенного гена, после введения в клетку находит свою мишень, гибридизуясь с ней, разворачивается и начинает светить.

Основные проблемы, возникающие при работе с биконами Высокая специфичность связывания с мишенью Устойчивость к действию внутриклеточных нуклеаз Необходимость обеспечения эффективной доставки бикона в нужный компартмент клетки и его удержание в этом компартменте Доступность мишени для гибридизации Высокая чувствительность, необходимая для изучения генов с низким уровнем экспрессии

Способы защиты биконов Подставка: Модифицированные олигобуквы:

Наиболее вероятная третичная структура молекулы мРНК гена CD3e

Рис.6 CD3_бикон с подставкой. Данные флюориметра

Рис.7 CD3_бикон с подставкой – кинетика (разгорание бикона без предварительной денатурации, в условиях конкуренции подставки и мишени)

Рис.8 CD19_бикон с подставкой

Рис.9 CD19 с подставкой – кинетика

Рис. 11. Результаты подсчета лимфоцитов, крашеных биконом к CD3 мРНК и антителами к СD3 белкам

Рис. 12. Результаты подсчета лимфоцитов, крашеных биконом к CD19 мРНК и антителами к СD19 белкам

Рис.13. Два CD3_бикона модифицированные. Данные флуориметра

Возможные причины провала Неэффективная гибридизация: в случаебикон с подставкой – конкуренция между подставкой и мРНК Неэффективная гибридизация: в случаемодифицированный бикон – низкая вероятность разворачивания бикона без предварительной денатурации Низкое соотношение сигнал/шум при проведении кинетики in vitro; шум приближается к смысловому сигналу

Выводы 1) Нами были выбраны CD3 и CD19 молекулы мРНК для гибридизации с молекулярными биконами. 2) Мы отобрали два дизайна биконов (модифицированные и с подставками). 3) Сравнение результатов метода визуализации мРНК в живых клетках с помощью молекулярных биконов с другими референсными методиками определения активности генов показало полный неуспех нашей затеи с биконами.

Благодарности Сергею Менделевичу Глаголеву за предоставленную возможность проведения практики Марии Андреевне Турчаниновой за чуткое научное руководство Денису Владимировичу Ребрикову за рецензию Персоналу ИБХ за помощь в проведении работы

Спасибо!