6. Многосубстратные ферментативные реакции. Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 6. Многосубстратные ферментативные реакции. Уравнения, описывающие эти реакции. Определение параметров в стационарном режиме. Порядок присоединения субстратов. Методы его определения

Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами 1.Последовательное связывание субстратов с образованием тройного комплекса:

Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами Двусубстратная Односубстратная реакция реакция реакция реакция S 1 >>S 2 Должен быть известен порядок присоединения субстратов

Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами Для схемы с последовательным связыванием субстратов уравнение скорости реакции: v=k 3 [ES 1 S 2 ] Для нахождения [ES 1 S 2 ] в систему уравнений добавляется уравнение материального баланса и условия квазистационарности: E 0 = [E] + [ES 1 ] + [ES 1 S 2 ]

Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами D E = k -1 k -2 +k 2 S 2 k 3 +k -1 k 3 ; ; D ES 1 = k 1 S 1 k 3 +k 1 S 1 k -2 D ES 1 S 2 = k 1 S 1 k 2 S 2

v = = Для определения параметров реакции из экспериментальных данных это уравнение можно линеаризовать : =

Определение величин коэффициентов φ i Накопление продукта реакции во времени при различных концентрациях S 1 и S 2 =const, или наоборот, при различных концентрациях S 2 и S 1 =const.

Определение величин коэффициентов φ i a=φ 0 +φ 2 /S 2 b=φ 1 +φ 12 /S 2

Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами 2.Произвольный порядок присоединения двух субстратов в процессе образования тройного комплекса: v = где D ES 1 S 2 – определитель узла графа, в котором происходит образование продуктов реакции.

Порядок присоединения субстратов От определения порядка присоединения субстратов зависит, какой схемой реакций будет описываться образование продукта и как будут рассчитываться параметры реакции.

Методы определения порядка присоединения субстратов Гель-фильтрацияГель-фильтрация. Метод задержки в гелеМетод задержки в геле (gel retardation, или electrophoretic mobility shift assay – EMSA). Тушение флуоресценцииТушение флуоресценции. Можно следить за изменением интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Trp) в белковой молекуле фермента, происходящим при комплексообразовании. Интенсивность флуоресценции при образовании комплекса с ферментом может изменяться и для субстрата. В этом случае можно использовать аналог субстрата, имеющий флуоресцентную метку.

Использование аналогов субстратов для определения порядка присоединения субстратов Аналоги субстратов выбираются таким образом, чтобы они продолжали быть субстратами, то есть участвовали в каталитических стадиях ферментативного процесса.Аналоги субстратов выбираются таким образом, чтобы они продолжали быть субстратами, то есть участвовали в каталитических стадиях ферментативного процесса. В случае аналога субстрата кинетические характеристики ферментативной реакции (K M, k cat ) могут измениться для тех стадий, в которых принимает участие данный субстрат (его аналоги).В случае аналога субстрата кинетические характеристики ферментативной реакции (K M, k cat ) могут измениться для тех стадий, в которых принимает участие данный субстрат (его аналоги).

Определение порядка присоединения субстратов Для исследования порядка присоединения субстратов в реакции аминоацилирования, катализируемой аминоацил-тРНК-синтетазами, были использованы фторированные аналоги аминокислот, например: Фенилаланин Парафтор-фенилаланин

Метод конкурентных ингибиторов Реакция аминоацилирования тРНК с образованием фенилаланил-тРНК, катализируемая фенилаланил-тРНК- синтетазой): E + АТР + Phe Е · [Phe~АМР] + рр i Е · [Phe~АМР] + тРНК Phe Е + Phe~тРНК Phe + АМР

Метод конкурентных ингибиторов Аминогруппа – при ее замене сродство субстрата к ферменту резко падаетАминогруппа – при ее замене сродство субстрата к ферменту резко падает Фенильная группа участвует в узнавании субстрата.Фенильная группа участвует в узнавании субстрата. Фенилаланинол (Phe-ol) – конкурентный ингибитор фенилаланина в реакции аминоацилирования.Фенилаланинол (Phe-ol) – конкурентный ингибитор фенилаланина в реакции аминоацилирования. Kd (Phe)=10 -6 M Kd (Phe-ol)=10 -5 M Фенилаланин Фенилаланинол

Метод конкурентных ингибиторов 1.Ингибитор образует комплекс с ферментом 2. Ингибитор образует тройной комплекс ES 1 I Для установления порядка присоединения субстратов нужно решить уравнения для схем 1 и 2, с помощью метода графов.

Показано экспериментально: чаще всего, в т.ч. в реакции аминоацилирования, первым субстратом является специализированный субстрат (кофермент-АТР), хотя комплекс фермента с коферментом ES 1 может быть менее прочным, чем комплекс фермента со вторым субстратом ЕS 2. При аминоацилировании тРНК Val на первом этапе происходит активация аминокислоты АТР: Е + АТР + Val ЕАМРVal + рр i Сначала в активном центре синтетазы от молекулы АТР отщепляются две фосфатные группы, образуя молекулу пирофосфата (ррi), и на их место становится аминокислота. Образованное соединение (аминоациладенилат) состоит из ковалентно связанных высокоэнергетической связью аминокислотного остатка и АМФ. Комплекс фермента с Val прочнее (K d =10 -6 M), чем комплекс с АТР (K d = M), но фермент при такой последовательности связывания дальнейшие реакции не катализирует.