МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И ФЕРМЕНТЫ РЕПЛИКАЦИИ ДНК Первый шаг на пути к пониманию ферментативного механизма репликации ДНК был сделан А. Корнбергом. В 1956 г., он выделил из клеток бактерии Е. coli фермент ДНК-полимеразу (впоследствии ДНК- полимераза I). Этот фермент осуществлял синтез ДНК при наличии в реакционной смеси всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и молекул ДНК:

n 1 ATP + n 1 AMP n 2 GTP РНК-полимераза+Mg 2+ n 2 GMP + (n 1 + n 2 + n 3 + n 4 )PP + ДНК + n 3 UMP n 3 UTP n 4 GMP + n 4 CTP В такой реакции количество ДНК увеличивалось в 20 раз по сравнению с внесенным изначально. По нуклеотидному соста- ву вновь синтезированная ДНК не отличалась от исходной. Однако оказалось, что ДНК-полимераза I не является истинной «репликазой». Что же происходит в реакции Корнберга?

При выделении из клеток ДНК рвется, так что образуются фрагменты с одноцепочечными 5'-концами. Каждый фрагмент с одноцепочечным 5'-концом используется в качестве матрицы для полимеризации комплементарных нуклеотидов, которые связываются с ней водородными связями. Более короткая цепь фрагмента, имеющая свободный 3'-конец, служит в качестве затравки, или праймера, к которой ковалентно поисоединяются полимеризуемые нуклеотиды (рис.1). Таким образом, ДНК-полимераза I Корнберга достраивает двуцепочечные участки на концах фрагментов ДНК, после чего реакция останавливается. Рис.1. Фрагмент ДНК, в котором имеются матрич- ная и затравочная нити. Пунктир показывает на- правление роста цепи ДНК, синтезируемой ДНК- полимеразой I.

Из бактериальных мутантов были выделены еще два фермента: ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III. Эти ферменты также достраивают двунитевые участ- ки на фрагментах ДНК с однонитевыми 5'-концами. В дальнейшем было показано, что именно ДНК-поли- мераза III участвует в синтезе полинуклеотидных цепей при репликации ДНК Е. coli. Тем не менее, ни одна из трех ДНК-полимераз Е. coli не может инициировать репликацию ДНК в отсут- ствие уже готового праймера (затравки). Начало син- теза ДНК инициацию репликации осущест- вляет иной фермент - РНК-полимераза. В качестве затравки при репликации бактериальной ДНК, ДНК-полимераза III использует полирибонукле- отид, синтезируемый на матрице ДНК.

В дальнейшем эти короткие (около 10 звеньев) молекулы РНК в ходе роста цепи (элонгации) удаляет ДНК-полимераза I, которая кроме полимеразной активности в направлении 5' 3' растущей цепи обладает 5' 3'- экзонуклеазной активностью, т. е. способна отщеплять нуклеотиды с 5'-конца. Благодаря объединению этих двух активностей в одной молекуле фермента ДНК-полимераза I удаляет РНК-праймер и одновременно заполняет образующуюся однонитевую брешь, полимеризуя дезоксирибонуклеотиды. Кроме этих двух активностей ДНК- полимераза I имеет еще и третью 3' 5'-экзонуклеазную. Благодаря этой активности ДНК-полимераза I осуществляет так называемые корректорские функции, удаляя ошибочно включенные в ДНК основания. 3- 5'-экзонуклеазная активность свойственна всем трем ДНК-полимеразам Е. coli, что обеспечивает высокую точность репликации ДНК.

Так как все ДНК-полимеразы для синтеза ДНК нуждаются в свободных 3'-ОН концах, то непрерывная репликация воз- можна только одной из двух комплементарных цепей с обра- зованием ведущей, или лидирующей цепи ДНК. Как же реплицируется вторая цепь? Р. Оказаки, используя кратковременное (несколько секунд) мечение реплицирующейся ДНК с помощью 3 Н-тимидина, показал, что значительная часть вновь синтезированной ДНК выделяется в виде коротких меченых фрагментов нуклеотидов. Эти фрагменты, получившие название фрагментов Оказаки, соответствуют коротким участкам репликации второй комплементарной цепи. На ней ДНК также синтезируется в направлении 5'3'. Каждый фрагмент Оказаки инициируется коротким полирибонуклеотидом (около 10 звеньев), который и служит затравкой для дальнейшего роста полидезоксирибонуклеотида (рис.2).

После удаления РНК и заполнения бреши с помо- щью ДНК-полимеразы I фрагменты соединяются ковалентно. Эту реакцию выполняет фермент ДНК- лигаза, замыкающая фосфодиэфирные связи. Нить ДНК, синтезиру- емая в виде фрагментов Оказаки, получила назва- ние запаздывающей. Рис. 2. Синтез ведущей (вверху) и запаздывающей (внизу) цепей молекулы

Молекулы ДНК в клетке суперспирализованы - двойная спираль образует витки более высокого порядка так на- зываемые супервитки. Необходимая предпосылка репликации раскручивание суперспирализованной ДНК, разделение и удержание комплементарных цепей в расправленном состо- янии, т. е. локальная денатурация или плавление ДНК. Все эти операции также осуществляют ферменты (рис.3). Сбрасывание супервитков (релаксацию молекул), проводят ферменты, относящиеся к классу топоизомераз. Особый белок, раскручивающий цепи, осуществляет плав- ление ДНК. Кроме того, особый класс белков, связывающихся с ДНК, удерживает нити ДНК разделенными. Это так назы- ваемые белки, дестабилизирующие двойную спираль. Благодаря действию всех этих белков на ДНК образуется участок локальной денатурации - две «вилки», в которых в дальнейшем и происходит репликация (рис.3).

Большинство ферментов, от- ветственных за репликацию ДНК (таблица 1), работает в мультиэнзимном комплексе, связанном с ДНК в виде так называемой реплисомы. Благодаря взаимодействию всех этих белков ДНК Е. coli реплицируется с огромной скоростью. Вся ДНК кишеч- ной палочки (4 х 10 6 п.н.) воспроизводится за 20 мин при 37°С. Скорость репликации достигает / 20 = 2х10 5 п. н. в 1 минуту, или около 3000 п. н. в 1 секунду. Рис. 3. Схема репликативной вилки

Таблица 1 Основные белки, осуществляющие репликацию ДНК у бактерий БелокФункция Топоизомераза Белок, раскручивающий двой- ную спираль (АТФ-зависи- мый) Белок, дестабилизирующий двойную спираль РНК-полимераза (праймаза) ДНК-полимераза II ДНК-полимераза III ДНК-лигаза Сбрасывание супервитков ДНК Плавление ДНК Стабилизация однонитевых разрывов Инициация синтеза ДНК Синтез ДНК, корректорские функции Удаление РНК затравки, заполнение одно- нитевых участков, корректорские функции Ковалентное соединение фрагментов Оказаки

Репликация у эукариот изучена не столь подробно, как у прокариот, но основные этапы так же, как и основные белки репликации, по своим функциям сходны у разных организмов. У эукариот скорость репликации значительно ниже ( п. н. в 1 с). При этом нужно учитывать, что их хромосомы полирепликонны в отличие от Е. coli, у которой вся хромосома один репликон. Репликоном называется единица репликации, в пределах которой она начинается и заканчивается. Как у прокариот, так и у эукариот репликация двунаправлена, т.е. вилки репликации, возникающие в зоне инициации репликации, удаляются друг от друга по мере синтеза ДНК до тех пор, пока они не встретятся с вилками репликации соседних репликонов или друг с другом, как это происходит у Е. coli, имеющей одну кольцевую хромосому.

Вопросы и задания 1. Почему при репликации одна из нитей ДНК реплицируется непрерывно, а другая – фрагментами? 2. Что такое праймер? Для чего он нужен ? 3. Нарисуйте схему репликативной вилки, подпишите названия белков, участвующих в репликации. 4. Чем отличается репликация ДНК у про- и эукариот?