Антиоксиданты, и способы их изучения Кафедра Медицинской Биофизики Медико-биологического факультета Российского Государственного Медицинского Университета 2007

Антиоксиданты - соединения, тормозящие процессы оксидативного стресса Оксидативный стресс - процесс, повреждения биологиеских структур, протекающий с участием свободных радикалов и/или активных форм кислорода

O-O HO-O HO-OH HO H 2 O (RO-O ) (RO-OH) (RO) Процесс последовательного одноэлектронного восстановления молекулы кислорода: Fe 2+

Антиоксидантная система водной фазы О2О2 Доноры электронов е-е- ОО - Супероксиддисмутаза НООН Каталаза НОНО2О2 Fe 3 + Fe 2 + Хелаторы Fe 3 + НО Инициация ПОЛ Антиоксиданты могут предотвращать цепное окисление липидов, реагируя с водорастворимыми радикалами или их предшественниками; мы назовем их антиоксидантами водной фазы. Супероксиддисмутаза, каталаза и хелаторы ионов железа, а также карнозин относятся к классу АВФ.

O-O HO-O HO-OH HO H 2 O (RO-O ) (RO-OH) (RO) Процесс последовательного одноэлектронного восстановления молекулы кислорода: Fe 2+ СОД

Метаболизм супероксида в биологических системах HO 2 СОД O2O2 + H2O2H2O2 КаталазаГлутатион-пероксидаза H2OH2OH2OH2O GSHGSSG Глутатион-редуктаза НАДФНАДФН Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа

Супероксиддисмутаза Супероксиддисмутаза (СОД) - единственный известный в настоящее время фермент, субстратом которого являются свободные радикалы. Она катализирует следующую реакцию: HO 2 + 2H + O 2 + H 2 O 2 Фермент, обнаруженный МакКордом и Фридовичем имеет молекулярную массу 32 кД и состоит из двух субъединиц, каждая из которых содержит по одному атому Сu и одному атому Zn: Сu 2+ Zn 2+

Дисмутация HО 2 супероксиддисмутазой Реакция катализируемая СОД состоит из двух стадий и заключается в переносе электрона с одного супероксидного радикала на другой. Промежуточным акцептором этого электрона служит атом меди, входящий в активный центр СОД: 1.СОД-Сu 2+ +HO 2 СОД-Сu + +O2O2 2.СОД-Сu + +O2O2 +2H + СОД-Сu 2+ +Н2О2Н2О2 Zn 2+ не участвует в каталитическом цикле, хотя и входит в активный центр. Ионы металлов защищают молекулу СОД от воздействий различных протеаз.

Дисмутация HО 2 супероксиддисмутазой Сu 2+ Zn 2+ O 2 *- Сu 2+ O 2 *- Сu 2+ O 2 *- Сu 2+ O 2 *- Сu 2+ O 2 *- Сu 2+ O 2 *- Сu 2+ O 2 *- Сu 2+ O2*O2* е-е- е-е- O2O2 е-е- O2O2 е-е- O2O2 е-е- O2O2 е-е- O2O2 Сu + O2O2 O2O2 2H + Сu + 2H + Сu + O2O2 2H + Сu + O2O2 2H + Сu + O2O2 2H + Сu + O2O2 2H + Сu + O2O2 2H + Сu + O2O2 2H + O2O2 O2O2 H2H2 Сu 2+ O2O2 H2H2 O2O2 H2H2 O2O2 H2H2 O2O2 H2H2 O2O2 H2H2 O2O2 H2H2 Реакция катализируемая СОД состоит из двух стадий и заключается в переносе электрона с одного супероксидного радикала на другой. Промежуточным акцептором этого электрона служит атом меди, входящий в активный центр СОД.

Измерение активности СОД Генерацию радикалов осуществляют: -физически (например, радиолиз, электролиз); -химически (например, распад пероксида и автоокисление); -биохимически (например, энзиматически с помощью КсО). Индикацию О 2 * - можно проводить непосредственно, измеряя его поглощение, либо опосредованно, с помощью измерения изменения свойств вспомогательного вещества или образования нового продукта. Здесь представлен метод фотохемилюминесценции: интенсивность люминесценции рибофлавина падает при добавлении СОД. Количество фермента приводящее к 50% падению сигнала принимается за единицу его активности Y ХЛ(units) Время (сек) X контроль(без СОД) в присутствии СОД

O-O HO-O HO-OH HO H 2 O (RO-O ) (RO-OH) (RO) Процесс последовательного одноэлектронного восстановления молекулы кислорода: Fe 2+ СОД Каталаза Пероксидаза

Деактивация перекиси водорода Перекись водорода (Н 2 О 2 ) - основной источник самых токсичных радикалов в живых системах - НО* радикалов. Следовательно, снижение уровня Н 2 О 2 приведет к снижению концентрации НО* радикалов. Удаление Н 2 О 2 осуществляют два класса ферментов: каталаза 2Н 2 О 2 каталаза 2Н 2 О+О2О2 пероксидазы Н2О2Н2О2 +АН 2 пероксидаза 2Н 2 О+А

Каталаза представляет собой гемовый фермент, состоящий из четырех субъединиц с общей молекулярной массой около 240 кД. В основе действия каталазы лежит вышеприведенная реакция, протекающая в две стадии: Н2О2Н2О2 Fe(III) Каталаза Н2О2Н2О2 Fe(III) Каталаза Н2О2Н2О2 Fe(III) Каталаза Н2О2Н2О2 Fe(III) Каталаза Fe(III) Н2О2Н2О2 Каталаза Соединение-1 Н2О2Н2О2 Н2О2Н2О2 Н2О2Н2О2 Н2О2Н2О2 Н2О2Н2О2 Fe(III) Каталаза Н2ОН2О О2О2 Н2ОН2О О2О2 Н2ОН2О О2О2 Н2ОН2О О2О2 Каталаза Н2О2Н2О2 Fe(III) Каталаза

Пероксидазы Пероксидазы также являются ферментами, разрушающими Н 2 О 2 нерадикальным путем и образующими Н 2 О; при этом окислению подвергается не вторая молекула Н 2 О 2, как в случае каталазы, а другие субстраты (АН 2 ). Рассмотрим реакцию с участием глутатион-пероксидазы: Глутатион-пероксидаза 2GSH Н2О2Н2О2 Н2О2Н2О2 Н2О2Н2О2 Н2О2Н2О2 Н2О2Н2О2 GSSG 2H 2 O GSSG 2H 2 O GSSG 2H 2 O GSSG 2H 2 O GSSG 2H 2 O GSSG

O-O HO-O HO-OH HO H 2 O (RO-O ) (RO-OH) (RO) Процесс последовательного одноэлектронного восстановления молекулы кислорода: Fe 2+ СОД Каталаза Пероксидаза Перехватчики радикалов

Перехватчики радикалов В качестве системы защиты организма от повреждающего действия радикалов кислорода могут выступать низкомолекулярные вещества, имеющие высокую константу скорости взаимодействия с этими радикалами: TАскорбиновая кислота (витамин С) Ta –токоферол (витамин Е) TСульфгидрильные соединения (глутатион, цистеин) TМочевая кислота TОдно- и многоатомные спирты (этанол, рибоза, глюкоза)

Принцип действия перехватчиков радикалов Антиоксидантные свойства обычно определяются как способность каких-либо соединений защищать от разрушающего действия свободных радикалов R + белки липиды Нукл. кислоты углеводы продукты деградации + антиоксидант продукты деградации антиоксиданта

Определение общей антиоксидантной активности (метод спин. лов.) R-N=N-R 2R + N 2 2ROO SA +O 2 +ST Время, мин Интенсивность сигнала, отн. ед. Контроль Тролокс 1 mM Иссл. в-во Тролокс 2 mM + исследуемое вещество или тролокс Конц. Тролокса (mM) 012 исследуемое в-во

R-N=N-R 2R + N 2 2ROO h +O 2 +Luminol Время, мин Интенсивность ХЛ, он. ед. контроль GSH 0,0002 мМ GSH 0,0005 мМ GSH 0,00075 мМ GSH 0,0015 мМ Концентрация GSH, мМ Лаг период, мин Определение общей антиоксидантной активности (метод хемилюминесценции) + исследуемое вещество или тролокс

Строение молекулы аскорбиновой кислоты (AscH 2 )

AscH 2 – двухосновная кислота При pH 7.4, 99.95% витамина C присутствует в виде AscH - ; 0.05% как AscH 2 и 0.004% как Asc 2-. Т.о., в реакциях витамина С в организме принимает участие преимущественно AscH -. O O OH HO HO OH AscH 2 O OH O HO O OH AscH - O O O HO O OH Asc 2 - рК 2 = 11,8 рК 1 = 4,1

Аскорбиновая кислота Отрыв одного электрона от аскорбиновой кислоты приводит к образованию семидегидроаскорбата, О О ОНОН СНОН СН 2 ОН е е е е е е е е О О ОО СНОН который в результате дальнейшего окисления переходит в дегидроаскорбат. еееееее е О О ОО СНОН СН 2 ОН Защитный эффект аскорбата основан на том, что образующиеся в результате его окисления промежуточные радикалы и молекулы менее активны, чем НО* радикалы.

Различные формы аскорбата

Продукты превращения аскорбата

Константы скорости взаимодействия аскорбата с некоторыми радикалами Приведенные константы скорости соответствуют реакции: AscH + R Asc + RH Радикалk эфф /М -1 с -1 (рН=7,4) HO (гидроксильный радикал) 1.1 x RO (трет-бутил алкоксильный радикал 1.6 x 10 9 RОO (алкил перекисный радикал) 2 x 10 6 GS (глутатиильный радикал) 6 x 10 8 UH (радикал мочевой кислоты) 1 x 10 6 TO (токофероксильный радикал) 2 x 10 5 Asc (дисмутация) 2 x 10 5 Fe(III)EDTA/ Fe(II)EDTA10 2 O2 -/НО2 2.7 x 10 5 Fe(III)десферал/ Fe(II) десфералОчень медленно

AscH - - это антиоксидант-восстановитель AscH - при взаимодействии с радикалом отдает атом водорода (H или H + + e - ) и дает трикарбонил аскорбатный радикал. AscH имеет pK a -0.86; т.е. В клетке радикал присутствует в виде Asc -.

Сигнал ЭПР Asc - Радикал аскорбата представляет собой дублетную линию. Интенсивность сигнала ЭПР Asc - может быть использована для оценки величины окислительного стресса in vitro и in vivo. a H = 1.8 G g = Гаусс

Сигнал ЭПР Asc - высокого разрешения a H 4 (1) = 1.76 Гс; a H 5 (1) = 0.07 Гс; a H 6 (2) = 0.19 Гс

Asc - - маркер окислительного стресса [Asc - ] ss – пропорциональна степени окисления аскорбата

Asc - - индикатор присутствия ионов переходных металлов В отсутствие ионов Fe окисление аскорбата происходит очень медленно. Приведенный график показывает зависимость [Asc - ] ss от различных концентраций [Fe(III)] в присутствии двух хелаторов – ЭДТА и Десферала. Поскольку железо в комплексе с ЭДТА доступно для восстановителей, этот комплекс может легко окислять AscH. Напротив, в комплексе с Десфералом железо не можетвзаимодействовать с восстановителями, поэтому комплекс Fe-Десферал не окисляет AscH. Fe(III)-десферал Fe(III)-ЭДТА [Fe(III)]/мкM [Asc.- ]

Аскорбиновая кислота Здесь представлено изменение кинетики хемилюминесценции, сопровождающей перекисное окисление липосом в присутствии аскорбиновой кислоты Время (мин) ХЛ (мВ) Аскорбат увеличивает латентный период хемилюминесценции, по-видимому, в результате регенерации двухвалентного железа, окисляющегося в ходе процесса липидной пероксидации.

Редокс-потенциалы некоторых радикалов

RRR- -токоферол CH 3 HH HO H3CH3C O 2R4R8R d- -токоферол

Функции витамина Е: Витамин Е является основным жирорастворимым антиоксидантом: 1.Он участвует в перехватывании перекисных радикалов 2.Защищает ненасыщенные жирные кислоты в мембранах и липопротеидах от ПОЛ

Различные формы токоферола

Различные формы токотриенолов

- токоферол CH 3 HO H3CH3C O COOH -токоферол CH 3 HO H3CH3C O COOH Продукты метаболизма витамина Е 2,5,7,8-тетраметил-2(2-карбоксиэтил)-6-гидроксихроман 2,7,8-триметил-2(2-карбоксиэтил)-6-гидроксихроман

Антиоксидантная роль витамина Е ПОЛ L-OO-H L-H LOO Перекисный радикал Инициирование цепи Продолжение цепи O2O2 С-центрированный радикал инициатор L ПОЛ L-OO-H Гидроперекись липида Ненасыщенный липид Гидроперекись липида

Антиоксидантная роль витамина Е ПОЛ LOOH LHLH LOO Перекисный радикал Инициирование цепи Продолжение цепи Обрыв цепи O2O2 С-центрированный радикал инициатор L T-O T-OH ПОЛ LOOH Гидроперекись липида Ненасыщенный липид Гидроперекись липида Ингибирование Малоактивный радикал

Перенос витамина Е (ТФ) к тканям и органам ЛНП ТФ Циркулирующие липопротеины ТФ Печень ТФ ЛВП Ткани хиломикроны Intestine кровоток кишечник

Причины дефицита витамина Е §Нарушение доставки: l Абеталипопротеинемия l Холестаз печени l Цистический фиброз §Врожденные нарушения белков, переносящих витамин Е l Семейный дефицит витамина Е l Атаксия Фридриха

Уровень -токоферола у здоровых доноров и больных атаксией

Средняя ежедневная потребность (СЕП) и рекомендуемое ежедневное потребление (РЕП) витамина Е (мг/день) ВозрастСЕП РЕП >19, M >19, Ж Беременность Кормление

Витамины С и Е являются сопряженными антиоксидантами Из таблицы редокс-потенциалов антиоксидантов можно видеть, что радикал токоферола (TO ) является более сильным окислителем, чем аскорбат (Asc - ). Это означает, что Asc - может восстанавливать TO : TO + AscH - TOH + Asc - Этот механизм особенно важен для защиты ЛНП от нежелательного окисления, т.к. ЛНП не содержат ферменты восстанавливающие TO.

Токоферол восстанавливает радикалы фосфолипидов витамин E O R R OH R XH O 2 X OO OO Фосфолипиды (ФЛ) Алкильный радикал ФЛ Перекисный радикал ФЛ

Аскорбат восстанавливает радикал витамина Е витамин E O R R O R OOH O R R OH R AscH - P L A 2 P h G P x FA-CoA G P x радикал витамина E PLA 2 – фосфолипаза А 2 GPx – глутатион-пероксидаза FA-CoA – алкил-СоА PhGPx – фосфолипид- глутатион пероксидаза Asc -

-токоферол -токоферол Время (мин) ХЛ (мВ) При действии -токоферола наблюдалось уменьшение интенсивности амплитуды медленной вспышки хемилюминесценции и удлинение латентного периода.

xxxxxxyyyyyy48 Номенклатура флавоноидов В основе всех флавоноидов лежит структура, содержащая ароматическое кольцо А, соединенное с гетеро- циклическим кольцом С и присоединенным через атом углерода С 2 вторым ароматическим кольцом. O OH O O OH O O O O OH O OH + Халкон O OH A B O OO O O A B C Флаванон Дигидрофлавонол Флаван-3-ол Флавон Флавон-3-ол Антоцианидин Изофлавон Неофлавон

xxxxxxyyyyyy49

O-O HO-O HO-OH HO H 2 O (RO-O ) (RO-OH) (RO) Процесс последовательного одноэлектронного восстановления молекулы кислорода: Fe 2+ СОД Каталаза Пероксидаза Перехватчики радикалов Хелаторы металлов

Хелаторы ионов металлов Основной механизм образования НО* радикалов - это восстановление Н 2 О 2 ионами Fe 2+. Поэтому связывание железа комплексообразователями должно привести к снижению концентрации этих радикалов. Среди таких соединений наиболее известны: TЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) TДесферал TКарнозин TЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) TДесферал TКарнозин

Fe становится нерастворимым благодаря гидролизу воды Хелатирование Fe и его растворимость Сильные хелатоы предотвращают гидролиз и образование нерастворимого Fe(OH) 3. OH 2 OH 2 H 2 O OH 2 OH 2 Fe H 2 O OH OH 2 H 2 O OH 2 OH Fe H 2 O O O H 2 O OH 2 OH 2 Fe OH 2 OH 2 OH 2 OH 2 H H 4+ H + H + Fe L: [Fe aq 3+ ] tot = pH 7 Высшие нерастворимые полимеры

Изменение редокс-потенциала Fe при хелатировании Fe(II) устойчивые комплексы - Fe(оксинат) 3 Гемовые комплексы гемоглобин миоглобин E o, В (возрастает способность к восстановлению) десферриоксамин Fe(III) устойчивые комплексы Fe(ЭДТА) Fe(оксалат) 3 Fe(салицилат) 3 Fe(CN) 6 Fe(OH 2 ) 6 Fe(тетрапиридил) 2 Fe(бипиридил) 3 Fe(фенантролин) 3

Различные типы лигандов Fe (I) (II) (III) (IV) (V) (VI) (VII)(VIII) (IX) Основными лигандами Fe в организме являются: амины (I), карбоксилы (II и VI), имидазолы (III), фенолы (IV), тиолы (V), катехолы (VII), гидроксаматы (VIII) и порфирины (IX). Образование комплексов приводит к изменению редокс-потенциала Fe.

Наиболее сильные хелаторы Fe энтеробактин Fe(III)-энтеробактин 110 = ; pFe = 35.5 десферриоксамин B ферриоксамин B 110 = ; pFe = 26.6 Сидерофоры, соединения, образуемые микроорганизмами, являются прочными хелаторами Fe(III). В комплексах, образуемые сидерофорами, ионы Fe имеют очень низкий редокс-потенциал и очень низкую каталитическую активность.

Десферал (десферриоксамин) Время (с) ХЛ (отн.ед.) Действие десферала (как и EDTA) заключается в уменьшении латентного периода хемилюминесценции, что, вероятно, связано с хелатированием ионов Fe 2+, которые при этом выпадают из реакций цепного окисления в липидной фазе.

Карнозин Концентрация (мМ) Время до максимума (с) Амплитуда ХЛ (мВ) При добавлении карнозина происходит уменьшение латентного периода, что,как и вслучае с дефералом и ЭДТА, также связано с хелатированием ионов железа.

Каротиноиды Действие каротина проявляется только в весьма высоких концентрациях, при которых наблюдаемое снижение интенсивности хемилюминесценции могло быть обусловлено (по крайней мере частично) реабсорбцией ХЛ этим соединением; изменение латентного периода при этом не происходило Время (мин) ХЛ (отн. ед.)

N-ацетил цистеин Только L-N-ацетил цистеин обладает биологическим действием. L-N-ацетил цистеин может превращаться в цистеин и далее в восстановленный глутатион. D-N-ацетил цистеин такими свойствами не обладает.

Метаболизм L-N-ацетил цистеина NAЦ Связывание с белками Таурин NAЦ N,N-диацетил цистеин Цистеин Комплексы лабильных дисульфидов с белками плазмы Глутатион Неорганические сульфиты Цистеин Цистериновая кислота Желчные кислоты Конъюгаты Желчных кислот

N-ацетил цистеин при ВИЧ: l Больные, инфицированные ВИЧ, обычно имеют пониженный уровень GSH и цистеина. Применение N-ацетил цистеина может полностью подавить воспалительную реакцию, стимулируемую репликацией вируса. l N-ацетил цистеин ингибирует активацию фактора NF- B, усиленную вследствие вирусной транскрипции и репликации.

N-ацетил цистеин в онкологии: l N-ацетил цистеин применяется при лечении онкологических заболеваний, таких как рак легкого, кожи, головы и шеи, молочной железы и печени. l N-ацетил цистеин облечает состояние больных при меланоме, аденоме предстательной железы и астроцитоме. Он ингибирует рост и пролиферацию опухолевых клеток. l Изучение моделей заболеваний на клеточных культурах и животных показало, защитное действие N-ацетил цистеина в отношении здоровых, но не злокачественных клеток, при интоксикациях, вызванных химиотерапией или облучением.

N-ацетил цистеин в кардиологии: l N-ацетил цистеин восстанавливает уровень GSH и тем самым снижает повреждения, вызванные ишемией и реоксигенацией. l N-ацетил цистеин повышает активность нитроглицерина. Потенцирует расширение коронарных сосудов и обладает анти аггрегационным эффектом. l Признаки ишемии миокарда, характеризующиеся подавлением ST-зубцов ЭКГ не наблюдаются, если пациенты принимали N-ацетил цистеин.