ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ И СТАБИЛЬНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ И КСИЛАНАЗ НА ОСНОВЕ ГРИБА TRICHODERMA REESEI Горячев Д.А. Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино (Россия) Лаборатория биосинтеза ферментов Зав. лабораторией: Окунев Олег Николаевич

ЦЕЛЛЮЛОЗА Частично деградиро- ванная ЦЕЛЛЮЛОЗА ЦЕЛЛОБИОЗАГЛЮКОЗА Эндоглюканазы (EG) Целлобиогидролазы (CBH) ß- Глюкозидазы (ß-G) ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Trichoderma reesei

ПРИМЕР 1. ПОЛУЧЕНИЕ СПИРТОВ ИЗ ОТХОДОВ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ Сбор и транспортировка ЦСС Предобработка ЦСС Ферментативный Сахара Ферментация гидролиз (осахаривание) Дегидратация. дистилляция Утилизация лигнина Одновременный гидролиз и ферментация Этанол, бутанол Целлюлазы, Гемицеллюлазы

ПРИМЕР 2. ВОЗДЕЙСТВИЕ ЦЕЛЛЮЛАЗ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗ (КСИЛАНАЗ) НА КОРМА Низкая пищевая ценность кормов Низкая пищевая ценность кормов Высокая вязкость содержимого кишечника Высокая вязкость содержимого кишечника Низкая степень конверсии корма Низкая степень конверсии корма Повышению пищевой ценности корма Повышению пищевой ценности корма Улучшению реоло- гических свойств содер- жимого кишечника Улучшению реоло- гических свойств содер- жимого кишечника Ускорению роста животного Ускорению роста животного Типичные проблемы Ферментные добавки приводят к:

ПРИМЕР 3. ПОЛУЧЕНИЕ СПИРТОВ ИЗ ОТХОДОВ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Отходы переработки яблок ПЕК, ГМЦ, ЦЕЛ Целлюлазы, гемицеллюлазы Сбраживаемые сахара (ксилоза, глюкоза) Ферментация Этанол, бутанол Дистилляция, дегидратация

Штамм КМЦ -аза, ед/мл Ксиланаза, ед/мл Белок, мг/мл Tr. TW1 исх ± ±9 4.6 ±0.05 Tr. TW ± ±8 8.1 ±0.03 Таблица 1. Активность целлюлазы (КМЦ-азы), ксиланазы и содержание белка при периодическом культивировании мутантов Tr. TW1 в колбах. Tr. TW-1-72 Тr. reesei 18-2 УФ-облучение отбор на среде с КМЦ Tr. TW-202 УФ-облучение отбор на среде с КМЦ Tr. TW-1 γ – облучение отбор на среде с КМЦ Рис.1. Схема получения мутантных штаммов с улучшенной продукцией целлюлаз и ксиланаз. Условия ферментации. Состав среды, г/л: КН 2 РО , (NH 4 ) 2 SO 4 – 4.6, MgSO 4 – 0.3, FeSO 4 – 0.02, MnSO , ZnSO 4 – 0.02, CaCl 2 – 0.3, кукурузный экстракт – 60, глюкоза – 50, МКЦ – 20. Активность ксиланазы и КМЦ-азы определяли по методу Шомоди-Нельсона, содержание внеклеточного белка по методу Лоури. ПОЛУЧЕНИЕ АКТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ TRICHODERMA REESEI TW-1 С ПОВЫШЕННЫМ СИНТЕЗОМ ЦЕЛЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ (ЦЕЛЛЮЛАЗ И КСИЛАНАЗ)

Рис. 2. Ферментационный комплекс «КФ-108» Рис. 3. Максимальные значения, полученные при ферментации мутанта и исходного штаммов Tr. TW-1 на лабораторной установке «КФ-108» КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МУТАНТА TRICHODERMA TW-1 В 1-ЛИТРОВЫХ ФЕРМЕНТЕРАХ «КФ-108» На рисунке 3 видно, что у отобранного штамма активности целлюлазы (КМЦ- азы) и ксиланазы увеличились по отношению к контрольному штамму TW1 в 2,5 и 1,8 раза соответственно, секреция внеклеточного белка повысилась в 1,5 раза.

ФЕРМЕНТАЦИЯ ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА TRICHODERMA TW-1-72 И ИСХОДНОГО TW-1 В 10-ЛИТРОВОМ ФЕРМЕНТЕРЕ «АНКУМ-2» В РЕЖИМЕ «FED BATCH» Условия ферментации. Подпитка в режиме «fed-batch» 41,2% раствором углеводов – 18,2 г углево- дов/л * час., при рН = 5,5, t 0 C - 32/28 0 C. Состав среды (г/л): глюкоза – 60, кук. экстр.–120, (NH 4 ) 2 SO 4 –6, KH 2 PO 4 – 3, CaCl 2 – 0.3, MgSO 4 * 7H 2 O – 0.3, FeSO 4 * 7H 2 O – 0.02, ZnSO 4 * 7H 2 O – 0.02, MnSO 4 * 5H 2 O – 0.02 рО 2 – 30% поддерживали оборотами мешалки Рис. 4. Максимальные значения, полученные при ферментации мутантных штаммов Tr. TW-1 на лабораторной установке «КФ-108»

ФЕРМЕНТАЦИЯ ПО ЗАВОДСКОЙ СХЕМЕ: рН – 4.5±0.25, t – 28/26ºC. ПОДПИТКА С ПОСТОЯННОЙ СКОРОСТЬЮ (ЛАКТОЗА:ЦЕЛЛЮЛОЗА:СОЕВАЯ МУКА). СОСТАВ СРЕДЫ, (Г/Л): KH 2 PO 4 – 5.4, (NH 4 ) 2 SO 4 – 8.5, MgSO 4 x 7H 2 O – 0.7, CaCl 2 - 0,7 FeSO 4 x 7H 2 O – , MnSO 4 x 5H 2 O , ZnSO 4 x 7H 2 O – , CoCl 2 х 6H 2 O – , лактоза – 15.0, Целлюлоза – 10.0, Соевая мука – ФЕРМЕНТАЦИЯ ПО НОВОЙ СХЕМЕ: рН – 5.5 ±0.25, t -32/28ºC. ПОДПИТКА С СПОСТОЯННОЙ СКОРОСТЬЮ (ЛАКТОЗА:КСИЛОЗА:ГЛЮКОЗА) СОСТАВ СРЕДЫ, (Г/Л): KH 2 PO , (NH 4 ) 2 SO 4 - 6, CaCl , MgSO 4 * 7H 2 O - 0.3, FeSO 4 * 7H 2 O – 0.02, ZnSO 4 * 7H 2 O – 0.02, MnSO 4 * 5H 2 O – 0.02, глюкоза - 60, кукурузный экстракт – 120. Целлюлоза – отсутствует, Соевая мука – отсутствует.

МАКСИМАЛЬНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ, ПОЛУЧЕННЫЕ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ TW-1-72 НА ЗАВОДСКОЙ И НА НОВОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ МАКСИМАЛЬНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ, ПОЛУЧЕННЫЕ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ TW-1-72 НА ЗАВОДСКОЙ И НА НОВОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

СТАБИЛЬНОСТЬ БИОСИНТЕЗА ЦЕЛЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ НОВОГО МУТАНТА TW1-72 В СЕРИИ ФЕРМЕНТАЦИЙ В РЕЖИМЕ «FED-BATCH» p = 0,95 n = 6

ВЫВОДЫ 1.Методами мутагенеза и селекции создан мутант Tr. TW-1-72, у которого продуктивность КМЦ-азы, ксиланазы увеличены в 2.5, 1.5 раза, соответственно, секреция внеклеточного белка повысилась почти в 2 раза по сравнению с исходным штаммом при культивировании в колбах. 2.Ферментация нового мутанта Tr. TW-1-72 в лабораторных ферментерах «КФ-108» позволила увеличить активность целлюлазы (КМЦ-азы) до 606 ед/мл и ксиланазы до 2562 ед/мл. Это уже конкурентноспособный уровень для получения промышленно значимых целлюлолитических ферментных препаратов. 3.Определен оптимальный режим ферментации полученного мутанта Tr. TW- 1-72, который значительно снижает стоимость затрат на получение ферментных препаратов. Биосинтетическая активность штамма при этом осталась на высоком уровне.

ЗАПЛАНИРОВАННЫЕ ИСССЛЕДОВАНИЯ 1. Проведение селекционных работ по поддержанию полученных штаммов. 2. Исследование осахаривающей способности ферментных препаратов на целлюлозосодержащих субстратах. 3. Масштабирование ферментационного процесса получения целевых ферментов.