1 МАКАРЕНКО АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ СУЛЬФОАРОМАТИЧЕСКИХ И ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДОВ COMAMONAS И PSEUDOMONAS - ДЕСТРУКТОРОВ п- ТОЛУОЛСУЛЬФОНАТА И ФЕНОЛА биотехнология Лаборатория биосенсоров ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина Научный руководитель д.х.н. Решетилов А.Н.

2 Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов Микробные биосенсоры Толуолсульфонат Фенол Практическое применение Изучение параметров биодеградации Микроорганизмы- деструкторы

3 Создание биосенсоров электрохимиче- ского типа для детекции сульфоаро- матических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструк- торами п-толуолсульфоната и фенола, соответственно. Цель работы

Задачи: 1. На основании имеющихся литературных данных произвести выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции п-толуолсульфоната и фенола и определить вид преобразования сигнала. 2. Оценить характеристики процесса деградации п- толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических и непрерывных условиях. Разработать лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Оценить возможность использования колоночного и мембранного сенсоров. 3. Выполнить сравнительную оценку характеристик биосенсоров для детекции п-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas. 4. Используя активный ил водоочистных сооружений в качестве биологического материала в реакторе с непрерывной подачей субстрата, оценить параметры процесса промышленных стоков от фенола. На основании полученных данных представить предложения по оптимизации процесса очистки сточных вод нефтеперерабатывающего производства.

5 Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов Микробные биосенсоры Фенол Микроорганизмы- деструкторы Толуолсульфонат Изучение параметров биодеградации Практическое применение

Биодеградация ТС свободными и иммобилизованными клетками C.testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических условиях Активность иммобилизованных клеток ниже на 25% по сравнению со свободными. Стехиометрическое соотношение ТС и кислорода 1:2 Схема деградации ТС по мета-пути (Балашов, 1997)

Деградация ТС в непрерывных условиях клетками C.testosteroni Исследован процесс деградации п-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 в периодических и непрерывных условиях. Потребление кислорода при разрушении п- толуолсульфоната происходит в стехиометрическом соотношении 2:1 (кислород: п-толуолсульфонат) свободными и иммобилизованными клетками.

8 Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов Микробные биосенсоры Толуолсульфонат Фенол Изучение параметров биодеградации Микроорганизмы- деструкторы Практическое применение

9 Калибровка сенсора для ТС на основе штамма C. testosteroni

10 Зависимость ответов моделей сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного вариантов штамма C. testosteroni от концентрации клеток в биорецепторном элементе

Субстратная специфичность сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного вариантов штамма C. testosteroni BS – толуолсульфонат 2 – фенол 3 – салицилат 4 – бензоат 5 – бензолсульфонат 6 – сульфобензоат 7– катехол 8 – алкилбензолсульфонат 9 – арабиноза 10 – арабит 11 – глицерин 12 – этанол 13 – глюкоза 14 – ксилоза 15 - ксилит 16 - метанол 17 - сорбит 18 - цитрат 19 - ацетат 20 - сорбоза 21 - ДДС-Na

На основе штамма C. testosteroni BS1310 (pBS1010) создан сенсор, позволяющий производить экспресс-анализ п-толуолсульфоната. Нижний предел детекции составлял 5 мкМ, верхний – 1 мМ. Чувствительность сенсора по отношению к тололсульфонату составляла 0.17 нА/с. Селективность в отношении п- толуолсульфоната сенсора, основанного на плазмидсодержащих бактериях, в 11 раз превышает селективность сенсора на основе бесплазмидного штамма.

13 Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов Микробные биосенсоры Толуолсульфонат Фенол Практическое применение Изучение параметров биодеградации Микроорганизмы- деструкторы

Субстратная специфичность фенолутилизирующих штаммов 1-фенол, 2-этанол, 3-глицерин, 4-сорбит, 5- сорбоза, 6-ксилоза, 7-бутанол, 8-изопропанол, 9- глюкоза, 10-катехол, 11-нафталин, 12-арабит, 13- ксилит, 14-метанол, 15-пропанол, 16-изобутанол, 17-ацетат, 18-п-толуолсульфонат, 19- бензолсульфонат, 20-арсенит, 21- динитроортокрезол, 22-гранозан. Штамм 32-I наиболее селективен по отношению к фенолу и имеет наибольшую амплитуду сигнала на введение этого вещества Наличие плазмиды у штамма 32-I определили в Лаборатории био-логии плазмид ИБФМ РАН

Субстратная специфичность сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного вариантов штамма 32-I Субстраты вводились в концентрации 10 мМ. Обозначение субстратов: фенол –1, катехол – 2, салицилат – 3, гентизат – 4, бензоат – 5, ДНФ – 6, ДНОК – 7,глюкоза – 8, сорбоза – 9, ксилоза -10, галактоза – 11, манноза – 12, изопропанол – 13, этанол – 14, бутанол – 15, метанол – 16.

Калибровка сенсора на основе штамма 32-I по фенолу Рабочий диапазон сенсора Угнетающее/ингибирующее влияние субстрата Произведен скрининг свойств 28 бактериальных штаммов рода Pseudomonas, полученных из образцов почв, загрязненных нефтепродуктами. Штамм 32-I характеризовал-ся наибольшей скоростью роста на феноле и был использован как основа биосенсора для детекции фенола.

Нижний предел детекции фенола в модельных условиях составлял 5 мкМ, верхний мкМ. Выполнено сравнительное исследование субстрат-ной специфичности биосенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов 32-I. Селективность в отношении фенола сенсора, основанного на плазмидсодержащих бактериях, в 17 раз превышает селективность сенсора на основе бесплазмидного штамма.

18 Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов Микробные биосенсоры Толуолсульфонат Фенол Практическое применение Изучение параметров биодеградации Микроорганизмы- деструкторы

Деградация фенола иммобилизованным активным илом в реакторе колоночного типа Кривая 1 – деградация на колонке без аэрации. Наблюдается лимит по кислороду. Кривая 2 – деградация на колонке с аэрацией, пропорциональная зависимость степени деградации от высоты колонки.

Выводы 1. Создана модель микробного биосенсора, обладающего высокой чувствительностью и селективностью в отношении сульфоароматических соединений. В основе биорецептора использован штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010) несущий плазмиду биодеградации сульфоароматических соединений pBS1010. Показано, что биосенсор мембранного типа позволяет0 производить экспресс-анализ п-толуолсульфоната в модельных средах в диапазоне детекции 5 – 1000 мкМ. Чувствительность сенсора по отношению к толуолсульфонату составляет 0.17 нА/с при концентрации 1 мМ. Использование плазмидсодержащих бактерий в сенсоре позволяет в 11 раз повысить селективность в отношении п- толуолсульфоната по сравнению с сенсором на основе бесплазмидного штамма.

2. Для упрощенной модели дифференциальной детекции произведена оценка возможной ошибки измерения целевых соединений - толуолсульфоната и фенола на фоне исследованных мешающих примесей. Нашли, что погрешность детекции составила бы 24% при определении п-толуолсульфоната, 11% при определении общего содержания сульфоароматических соединений, 35% при определении фенола и 12% при определении общего содержания ароматических соединений в случае равной концентрации как мешающих, так и целевых соединений. При анализе реальных сточных вод, содержащих преимущественно целевые соединения, погрешность должна существенно снизиться.

3. Впервые экспериментально показали, что окисление п-толуолсульфоната бактериальными клетками Comamonas testosteroni BS1310 как в свободном, так и в иммобилизованном состоянии происходит в стехиометрическом соотношении 2:1 (кислород: п-толуолсульфонат). Полученные данные составили основу для выбора типа биорецептора – мембранного или колоночного - при создании биосенсора для детекции данного соединения.

4. Бактериальный штамм, принадлежащий к роду Pseudomonas (рабочая маркировка "32- I"), использовали как основу биосенсора для детекции фенола. Измерение концентрации фенола было возможно в диапазоне мкМ. Нашли, что в отношении фенола селективность сенсора, основанного на плазмидсодержащих бактериях, в 17 раз превышает селективность сенсора на основе бесплазмидного штамма. Изучили параметры биосенсора и их зависимость от внешних условий.

24 5. На основании выполненных тестов с активным илом, имитирующим фун- кционирование биологического материала в составе биосенсора, представили реко- мендации по оптимизации работы водоочистных сооружений нефтепере- рабатывающего производства, заключа- ющиеся в проведении контроля степени оксигенации стоков. Полученные данные позволили на практике на 17% увеличить степень очистки стоков, содержащих фенол (оценка по индексу ХПК).