Экспресс-методы проточного латерального иммуноанализа для определения маркеров рака простаты, острого инфаркта миокарда и аллергии А.П.Осипов, В.Г.Григоренко, И.П.Андреева, Е.А.Яковлева, А.М.Егоров Кафедра Химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва, Ленинские Горы, 1, стр.3 МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва, Ленинские Горы, 1, стр.3 Закрытое акционерное общество «НВО Иммунотех», Москва, Ленинские Горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, 1, стр.11а

Продажи быстрых тестов для медицинской диагностики в мире Диагностические направления ОБЪЕМ ПРОДАЖ В 2007 г., млн $ ДОЛЯ НА РЫНКЕ, % ОБЪЕМ ПРОДАЖ В 2012 г., млн $ ДОЛЯ НА РЫНКЕ, % ГОДОВОЙ ПРИРОСТ, % БЕРЕМЕННОСТЬ ИНФЕКЦИИ КАРДИОМАРКЕРЫ ХОЛЕСТЕРИН / ЛИПИДЫ ЛЕКАРСТВА ДРУГИЕ (ТТГ, ПСА, ФСГ и т.д.) ВСЕГО

ЧИСЛО ПУБЛИКАЦИЙ ПО МЕТОДАМ ПРОТОЧНОГО ЛАТЕРАЛЬНОГО ИММУНОАНАЛИЗА ПО ГОДАМ

ОСНОВНЫЕ ДОСТОИНСТВА МЕТОДОВ ЛАТЕРАЛЬНОГО ПРОТОЧНОГО ИММУНОАНАЛИЗА Короткое время анализа (5-10 минут) Короткое время анализа (5-10 минут) Хранение при комнатной температуре Хранение при комнатной температуре Срок хранения тестов 24 месяца Срок хранения тестов 24 месяца Полная готовность к использованию Полная готовность к использованию Минимальный требуемый объем образца Минимальный требуемый объем образца Система внутреннего контроля Система внутреннего контроля

СТРОЕНИЕ ТЕСТ-ПОЛОСКИ ДЛЯ ЛАТЕРАЛЬНОГО ПРОТОЧНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (Иммунохроматографический анализ) Образец Мембрана для конъюгата золота с Ат Впитывающая мембрана Мембрана для Пластмассовая основа нанесения образца Нитроцеллюлозная Тестовая Контрольная мембрана линия линия - специфические антитела - вторичные антитела

МЕМБРАННАЯ СИСТЕМА ПОДЛОЖКА ДЛЯ КОНЪЮГАТА ПОДЛОЖКА ДЛЯ ОБРАЗЦА СОРБЦИЯ АНТИТЕЛ ВЫСУШИВАНИЕ КОМПОНОВКА МЕМБРАН, ПОДЛОЖКИ ДЛЯ КОНЪЮГАТА И ОБРАЗЦА, ЛАМИНИРОВАНИЕ ПРЕДОБРАБОТКА ПОЛУЧЕНИЕ, СТАБИЛИЗАЦИЯ И НАНЕСЕНИЕ КОНЪЮГАТА РЕЗКА ГОТОВЫХ КАРТОЧЕК НА ПОЛОСКИ УКЛАДКА ПОЛОСОК В ПЕНАЛЫ ИЛИ КАССЕТЫ УПАКОВКА КАССЕТ В ФОЛЬГУ Основные технологические стадии процесса производства быстрых тестов БЛОКИРОВКА ВЫСУШИВАНИЕ

Свойства наночастиц золота с различным размером Размер частиц (nm) Площадь поверхности (nm 2 ) Число молекул IgG на частицу

Влияние рН и концентрации антител на стабильность конъюгатов золота

Структура аналитической нитроцеллюлозной мембраны

Зависимость скорости распространения потока вдоль мембраны от расстояния

ВЫБОР ТИПА АНАЛИТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ мАт иммобилизованы на мембране конъюгат мАт с наночастицами золота

Компоновка мембран с помощью ламинатора

Резка мембранных полосок

РАЗЛИЧНЫЕ ФОРМАТЫ ГОТОВЫХ УСТРОЙСТВ ДЛЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

ИммуноХА-ПСА-экспресс ЗАО «НВО Иммунотех»

Интерпретация результатов анализа ПСА иммунохроматографическим тестом производства «НВО Иммунотех» a – отрицательный; б, в – положительный; г, д, е, ж – ошибочный Контрольная линия 1-ая тестовая линия 2-ая тестовая линия Мембрана для нанесенияобразца а б в г д е ж а б в г д е ж а) концентрация ПСА менее 3 нг/мл б) концентрация ПСА в диапазоне от 3 до 10 нг/мл в) концентрация ПСА выше 10 нг/мл

ИммуноХА-ПСА-экспресс ЗАО «НВО Иммунотех» СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА 1. Нанести 30 мкл образца на край тест-полоски. 2. Погрузить нижний край тест-полоски в лунку с буферным раствором. 3. Через 15 мин визуально оценить результат (одна розово-фиолетовая линия – менее 3 нг/мл, две - от 3 до 10 нг/мл, три - более 10 нг/мл). ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА Чувствительность: не более 3 нг/мл Чувствительность: не более 3 нг/мл Специфичность: не наблюдается перекрестных реакций с Специфичность: не наблюдается перекрестных реакций с другими компонентами сыворотки крови другими компонентами сыворотки крови Диапазоны определяемых Диапазоны определяемых концентраций: первый - менее 3 нг/мл; концентраций: первый - менее 3 нг/мл; второй - от 3 до 10 нг/мл; второй - от 3 до 10 нг/мл; третий - более 10 нг/мл третий - более 10 нг/мл Условия инкубации (время, t о С) : 15 мин при +(20-25) о С Условия инкубации (время, t о С) : 15 мин при +(20-25) о С Время проведения анализа: 15 минут Время проведения анализа: 15 минут Количество анализируемой Количество анализируемой сыворотки: 30 мкл сыворотки: 30 мкл Количество анализов: 20 исследуемых образцов Количество анализов: 20 исследуемых образцов Срок годности набора: 12 месяцев Срок годности набора: 12 месяцев

Экспресс-исследование уровня тропонина и миоглобина – необходимый этап диагностики и мониторинга больных с острым инфарктом миокарда, инсультом и стенокардией Стандарты утверждены приказами MЗ РФ Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 2 августа 2006 г. N 582 "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с острым инфарктом миокарда" Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 2 августа 2006 г. N 582 "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с острым инфарктом миокарда" "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с острым инфарктом миокарда" "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с острым инфарктом миокарда" Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 5 сентября 2006 г. N 643 "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с инсультом, не уточненным как кровоизлияние или инфаркт" Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 5 сентября 2006 г. N 643 "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с инсультом, не уточненным как кровоизлияние или инфаркт" "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с инсультом, не уточненным как кровоизлияние или инфаркт" "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с инсультом, не уточненным как кровоизлияние или инфаркт" Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 25 сентября 2006 г. N 671 "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным со стенокардией (грудной жабой)" Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 25 сентября 2006 г. N 671 "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным со стенокардией (грудной жабой)" "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным со стенокардией (грудной жабой)" "Об утверждении стандарта медицинской помощи больным со стенокардией (грудной жабой)" Приказ Минздравсоцразвития России 599н от 19 сентября 2009 г. Приказ Минздравсоцразвития России 599н от 19 сентября 2009 г. "Об утверждении Порядка оказания плановой и неотложной медицинской помощи населению Российской Федерации при болезнях системы кровообращения кардиологического профиля" "Об утверждении Порядка оказания плановой и неотложной медицинской помощи населению Российской Федерации при болезнях системы кровообращения кардиологического профиля" "Об утверждении Порядка оказания плановой и неотложной медицинской помощи населению Российской Федерации при болезнях системы кровообращения кардиологического профиля" "Об утверждении Порядка оказания плановой и неотложной медицинской помощи населению Российской Федерации при болезнях системы кровообращения кардиологического профиля"

Маркеры ОИМ Белок, связывающий жирные кислоты (с-БСЖК) Комплекс тропонина NМаркер Пороговый уровень Максимум Нормализация параметра Специ- фичность, % Тропонин I 1 нг/мл ч дней 91 Миоглобин 90 нг/мл 4-6 ч ч 60 с-БСЖК 6 нг/мл 4-6 ч ч 93

Определение с-БСЖК в сыворотках крови для диагностики острого инфаркта миокарда Пациент 13 (Клиническая больница 67) 1.Контрольная группа (N=25) - c-БСЖК не был обнаружен 2. Пациенты с подтвержденным диагнозом острого инфаркта миокарда (N=13) – с-БСЖК обнаружен во всех образцах, взятых у пациентов при поступлении в больницу 1 – при поступлении 5 – через 24 часа 2 – через 6 часов 6 – через 30 часов 3 – через 12 часов 7 – через 36 часов 4 – через 18 часов 8 – через 42 часа

Тесты для диагностики острого инфаркта миокарда Rennesens GmbH, Germany Трехкомпонентный Кардиотест «ИммунТех», YD Diagnostics, Ю.Корея (Юнимед) Duo Troponin I - MGL Test, «VedaLab», (Диакон) Cortez Diagnostics, US

ПОРТАТИВНЫЙ ПРИБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ ОКРАСКИ ЛИНИЙ фирмы ESE GmbH (Германия)

Прибор для регистрации интенсивности цвета тестовых линий фирмы «Микроанализ» (Россия)

Характеристики разработанной тест-системы для определения общего IgE МЕ/мл Предел обнаружения: Предел обнаружения: 5 ME/мл 5 ME/мл Диапазон определяемых Диапазон определяемых концентраций : концентраций : МЕ/мл Коэффициент вариации: Коэффициент вариации: 2-10% 2-10% Время анализа : Время анализа : 10 – 15 минут 10 – 15 минут

Корреляция результатов определения концентраций общего IgE в сыворотках крови методами ИФА и ИХА

ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ МЕТОДОВ ЛАТЕРАЛЬНОГО ПРОТОЧНОГО ИММУНОАНАЛИЗА Разработка количественных методов анализа Разработка количественных методов анализа Повышение чувствительности и воспроизводимости анализа Повышение чувствительности и воспроизводимости анализа Использование новых классов меток Использование новых классов меток Разработка мультикомпонентных систем анализа Разработка мультикомпонентных систем анализа Разработка новых платформ проведения анализа Разработка новых платформ проведения анализа Уменьшение стоимости Уменьшение стоимости

- наночастицы золота - наносферы (nanospheres) - квантовые точки (Quantum dots, QD) - наночастицы золота - наносферы (nanospheres) - квантовые точки (Quantum dots, QD) Типы визуальных меток для быстрых тестов Типы визуальных меток для быстрых тестов

Основные этапы синтеза золотых нанооболочек с ядром из диоксида кремния ( нм) ТЭОС – тетраэтилортосиликат АПТЭС – 3-аминопропилтриэтоксисилан АПТЭС

КВАНТОВЫЕ ТОЧКИ

Спектральные характеристики квантовых точек Квантовые точки – CdSe/ZnS CdTe/ZnS Размер 1-10 нм 1,3 нм 2 нм 2,5 нм 5 нм 7 нм