Функции белков и генов I keep six honest serving-men (They taught me all I knew); Their names are What, and Why, and When, And How, and Where, and Who. Rudyard Kipling

План Что важно знать функции данного белка и где это найти? Как найти все белки с определенной функцией? Как бороться с синонимами? База данных GO: структура; использование Что такое Protein evidence?

Задача I: узнать функцию белка Пример: что за белок Q71SG9_KLEPN Название (кто?) – Uniprot: Cytosine-specific methyltransferase ген kpn2kIM Откуда? Klebsiella pneumoniae плазмида

Q71SG9_KLEPN Что делает? – Pubmed: статей нет ссылка на Gene DB (NCBI) (часть проекта RefSeq): – type II DNA-methyltransferase Кто – ближайший изученный гомолог? – BLAST MTS2_SHISO, Identity 100% по всей длине (!?) – M.SsoII, Shigella sonnei, плазмида

M.SsoII

Что делает? – Pubmed: есть статьи; нет обзоров Uniprot ссылается на разные БД – GO: (F) Molecular Function: Catalysis of the reaction: S-adenosyl-L-methionine + DNA containing cytosine = S-adenosyl-L-homocysteine + DNA containing 5-methylcytosine Переносит метильную группу с кофактора на цитозин ДНК приведен список из 20 синонимов

M.SsoII Uniprot ссылается на разные БД (продолжение) – GO: : (F) Name: sequence-specific DNA binding Molecular Function: Interacting selectively and non-covalently with DNA of a specific nucleotide composition, e.g. GC-rich DNA binding, or with a specific sequence motif or type of DNA e.g. promotor binding or rDNA binding. – EC Catalysis of the reaction: S-adenosyl-L-methionine + DNA containing cytosine = S-adenosyl-L-homocysteine + DNA containing 5-methylcytosine COMMENT * See the REBASE database for a complete list of these enzymes: приведен список из 20 синонимов

Мы описали МОЛЕКУЛЯРНУЮ ФУНКЦИЮ белка M.SsoII (и гомолога из K.pn.)

M.SsoII Каков механизм работы? кофактор SAM (S-adenosyl-L-methionine) на какой атом ДНК переносится – углерод в 5-м положении цитозина как фермент, кофактор и субстрат расположены в пространстве? 3D структуры нет; есть модель, построенная по гомологам доменов с известной структурой. Цитозин выворачивается, см. рис. как устроен активный центр? – известны консервативные мотивы и остатки как происходит узнавание последовательности ДНК? – известна узнаваемая последовательность – CCNGG - и домен, отвечающий за узнавание (TRD) …. Методы: – Пришивка (cross-linking) – Мутагенез – ….. – моделирование структуры – консервативность последовательностей …. – ….. множество всего Модель метилазного домена M.SsoII Метилируемый цитозин SAM

Описали МЕХАНИЗМ действия M.SsoII

M.SsoII: зачем нужно метилировать ДНК? Зачем? – GO: : (P) Name: DNA restriction-modification system Biological Process: Any process that protect an organism from invading foreign DNA by methylation of self DNA at specific sequences and nucleolytic cleavage of unmethylated foreign DNA. Система рестрикции-модификации: любой процесс, защищающий организм от вторжения чужеродной ДНК посредством метилирования специфических последовательностей и гидролиза неметилированной чужеродной ДНК Чужеродная ДНК – ДНК бактериофагов, плазмид и др. Какие гены включает система РМ? Rebase: – M.SsoII: » M.SsoII – ДНК метилтрансфераза » SsoII – эндонуклеаза рестрикции SsoII - вносит двухцепочечный разрыв ДНК в неметилированных сайтах CCNGG M.SsoII метилирует цитозин только в сайтах той же последовательности CCNGG; метилируя хозяйскую ДНК M.SsoII предотвращает фрагментацию собственного генома

Мы описали БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС и систему генов его осуществляющих

M.Kpn2kI и M.SsoII В каком организме? – Klebsiella pneumoniae плазмида – Shigella sonnei, бактерия из семейства Enterobacteriaceae; патоген плазмида – Сходство 100%; как объяснить?

M.SsoII Какие еще функции известны? – Pfam: два домена – GO: : (P) regulation of transcription; IEA:UniProtKB-KW. регулятор транскрипции: связывается с сайтами NNNNNN; такие сайты расположены между генами M.SsoII и SsoII репрессор гена M.SsoII и активатор SsoII – для чего? для размножения плазмиды: проникновения в нового хозяина – механизм регуляции? имеет N-концевой HTH домен, гомологичный известным доменам транскрипционных факторов димеризуется при связывании с ДНК – еще одна функция: способность димеризации

M.SsoII Где локализуется? в цитоплазме хозяйской бактериальной клетки – а точнее? ….. Когда экспрессируется? небольшая поддерживается постоянно; авторегуляция при проникновении в нового хозяина увеличивается ЛОКАЛИЗАЦИЯ и ЭКСПРЕССИЯ

Итог: M.SsoII (и M.Kpn2kI) Функции: – метилирование цитозина в сайтах CCNGG – связывание с ДНК в сайтах определенной последовательности – гомодимеризация при связывании с ДНК Механизм: – узнавание последовательности – TRD домен – кофактор SAM – мотивы I - X – выворачивание основания – ход реакции Биологический процесс: – защита от чужеродной ДНК – регуляция транскрипции системы РМ SsoII Система рестрикции-модификации II типа; состоит из двух генов на трансмиссивной плазмиде Локализация: – цитоплазма хозяйской клетки Экспрессия – негативная авторегуляция

Базы данных Uniprot Pubmed GO – gene onthology EC - enzyme classification Pfam, Interpro, а также Prosite, Panther, Prints, TIGERFam, SMART, Supfam – семейства белков/доменов Brenda - The Comprehensive Enzyme Information System Rebase – специализированная БД

Где искать описание функции Краткое описание функций одного белка и ссылки на другие ресурсы см. Краткое описание функций семейств белков и доменов см. в и Подробное описание функций генов и их продуктов см в энциклопедиях, таких как или Подробное описание отдельных классов функций и соответствующих белков см. в специализированных БД, таких как ENZYME,Rebase,...

Как нам узнать функцию интересующего нас и б.м. известного науке белка или гена? +/+++ Читайте оригинальные статьи хороших авторов в хороших журналах! Ищите в PubMed -/++ Читайте аннотации записи Uniprot Используйте SRS -/+ Читайте аннотации записей Pfam и InterPro, содержащие описания семейств доменов, к которым принадлежат домены белка -/+ Ищите ваш белок в специализированных БД (БД и энциклопедии, в которых подробно описаны функции генов и их продуктов : KEGG, BIOCYC, ENZYME, TC-DB, REACTOME….) Ищите, предположительно, гомологичные белки самостоятельно. Используйте BLAST, psiBLAST, профили и паттерны

Задача II: найти белки с той же функцией Та же молекулярная функция? – в аннотации записи Uniprot нужные термины GO, помеченные F (molecular function) нужные коды EC Тот же механизм? ….. функция + гомология Тот же биологический процесс? нужные термины GO, помеченные P (biological process) Та же система генов? БД систем: KEGG, SEED, … Та же локализация? нужные термины GO, помеченные С (cellular component)

Что бывает Верно ли, что у белки всегда есть главная функция? нет; цитохром с: окислительное фосфорилирование индукция апоптоза Верно ли, что гомологичные белки имеют ту же основную функцию? часто, но не всегда! Верно ли, что белки с той же функцией гомологичны? часто, но не всегда! (карбоангидраза) Верно ли, что белки с одинаковой функцией участвуют в тех же биологических процессах? не обязательно! (ДНК-метилтрансферазы) Верно ли, что один и тот же биологический процесс реализуется сходными системами генов? не обязательно! (лекарственная устойчивость)

Figure 1. Specific example of convergent and divergent evolution. Top, an example of convergent evolution, showing structures of two carbonic anhydrases with the same enzymatic function (EC number ), but with different folds. The Figure was drawn with Molscript (Kraulis, 1991) from 1THJ (left-handed beta helix) and 1DMX (¯at beta sheet). Hedi Hegyi and Mark Gerstein J. Mol. Biol. (1999) 288, 147±164

Пробуем выделить классы белков по функции Молекулярные машины – рибосома [&&&] Ферменты - РНК-зависимая РНК полимераза [рабочие на производстве] Регуляторные белки – регулируют биологические процессы, например, активность ферментов – TetR [бюрократия] Хранение и транспорт (ионов, маленьких молекул) – гемоглобин [складские рабочие] Транспорт через мембраны – TetA [таможенники] Секреторные, взаимодействие с другими клетками – инсулин [командировочные?] Структурные [атланты ] Сигнальные [ ] Рецепторы [] Мотор []

Проблема неоднозначности терминологии

Питер Брейгель старший "Вавилонская башня" 1563 Музей истории искусств, Вена

Проект GO (Gene Ontology ) Цель: Создание унифицированной терминологии для аннотации генов БД GO Включает три независимых словаря Молекулярные функциии (molecular Function) (Как? С чем?) Например, carbohydrate binding или ATPase activity Биологические процессы (biological Process) (Зачем?) Например, митоз или биосинтез пуринов Клеточные компоненты (cellular Component) (Где?) Например, ядро или холофермент РНК-полимераза II В консорциум GO входит EBI (БД Uniprot, Interpro) и много других организаций GOA – проект описания записей Uniprot терминами GO – 94% записей Swissprot и 65% Trembl имеют хотя бы один термин GO

Запись GO называется термин GO Термины имеют определение и перечень синонимов. Термины в пределах одной онтологии (словаря) связаны отношениями is_a", is_part_of Термины имеют стандартные идентификаторы: GO: (пример)

tricarboxylic acid cycle Accession: GO: Ontology: biological_process Synonyms: exact: citric acid cycle exact: Krebs cycle exact: TCA cycle Definition: A nearly universal metabolic pathway in which the acetyl group of acetyl coenzyme A is effectively oxidized to two C02 and four pairs of electrons are transferred to coenzymes. The acetyl group combines with oxaloacetate to form citrate, which undergoes successive transformations to isocitrate, 2-oxoglutarate, succinyl-CoA, succinate, fumarate, malate, and oxaloacetate again, thus completing the cycle. In eukaryotes the tricarboxylic acid is confined to the mitochondria. See also glyoxylate cycle.

Directed acyclic graph DAG ориентированный ациклический граф отношение "is_part_of": "A is part of B" означает, что А часть В, но В не обязательно содержит А. отношение "_is_a": "A is B" означает, что А частный случай В;

The Gene Ontology database Apoptotic protease activator Gene OntologyApoptosis regulatorEnzyme activatorApoptosis activatorProtease activatorMolecular function

Аннотация GO записей Uniprot Два принципа: – каждая аннотация должна ссылаться на источник: – литературная ссылка – другая база данных – компьютерное предсказание – ……. – аннотация должна указывать на достоверность применимости термина GO к данному белку в источнике (kind of evidence)

Аннотация GO для MTS2_SHISO (UniProt)

Evidence Codes IDA Inferred from Direct Assay TAS Traceable Author Statement IMP Inferred from Mutant Phenotype IGI Inferred from Genetic Interaction IPI Inferred from Physical Interaction RCA Inferred from Reviewed Computational Analysis ISS Inferred from Sequence Similarity IEP Inferred from Expression Pattern NAS Non-traceable Author Statement IEA Inferred from Electronic Annotation IC Inferred by Curator ND No biological Data available

Предостережение: GO не является номенклатурой генов или их продуктов (белков). Словари описывают биологические феномены (например, программируемую клеточную смерть), а не конкретные биологические объекты

Есть и другие онтологии, например, exon, promoter, binding_site, non_canonical_splice_site, stop_codon. pseudogene

Резюме Функциональная аннотация геномов задача биоинформатики Существуют энциклопедии, где можно узнать о функциях генов и их продуктов, например, BioCyc. Полное описание функции это ответы на вопросы "где?", "зачем?", "как?, "с чем?. GO перспективный подход к разработке общего языка (решение проблема синонимов), разработке формализованного описания функций, общего для всех организмов.

The End