CP Генетические основы СМА и патогенетической терапии

CP Wang CH, et al. J Child Neurol (8): Lunn MR and Wang CH. Lancet : SMA Foundation. SMA Overview Kolb SJ and Kissel JT. Arch Neurol (8): Определение спинальной мышечной атрофии СМА является нервно-мышечным заболеванием, характеризующимся дегенерацией моторных нейронов 1,2 У пациентов наблюдаются прогрессирующая мышечная атрофия и слабость 1,2 Когнитивные функции и интеллект не затронуты 3 Описаны несколько подтипов СМА в зависимости от возраста начала заболевания и степени развития двигательных функций 4

CP Sugarman EA, et al. Eur J Hum Genet (1): Jones C, et al. CureSMA SMA Foundation. SMA Overview. СМА - генетическое заболевание В большинстве случаев СМА обусловлена гомозиготной делецией/мутацией гена SMN1 (белок выживаемости мотонейронов 1) 1 Частота носителей по оценкам составляет от 1/40 до 1/60 во всем мире 1 По оценкам, заболеваемость СМА составляет от 5,1 до 16,6 случаев на родившихся живыми ежегодно 2 Величина заболеваемости СМА схожа с таковой для муковисцидоза и мышечной дистрофии Дюшенн 3

CP SJ. Kolb, JT. Kissel Spinal Muscular Atrophy. A Timely Review. Arch Neurol Aug; 68(8) Краткое описание биосинтеза белка ДНК образовано парами оснований (A = аденин, C = цитозин, G = гуанин и T = тимин), которые кодируют последовательность аминокислот в белке 1 Транскрипция (и сплайсинг) - это преобразование информации, хранящейся в ДНК, в матричную РНК (мРНК)¹ Трансляция - это преобразование информации, хранящейся в мРНК, в белок 1 ДНК = дезоксирибонуклеиновая кислота РНК = рибонуклеиновая кислота ДНКмРНК Белок Транскрипция Трансляция

CP SJ. Kolb, JT. Kissel Spinal Muscular Atrophy. A Timely Review. Arch Neurol Aug; 68(8) Транскрипция и сплайсинг Изображение с изменениями взято из: gif Сплайсосома Сплайсированная РНК Интрон После транскрипции пре-мРНК состоит из экзонов, которые остаются в зрелой мРНК, и интронов, которые вырезаются в процессе сплайсинга 1. Молекула ДНК, с которой идет транскрипция мРНК Направление транскрипции РНК-полимераза РНК пре-мРНК транскрипт

CP Трансляция Во время трансляции информация, закодированная в зрелой мРНК, используется для построения аминокислотной последовательности белка тРНК = транспортная РНК Движение рибосомы мРНК Аминокислота Рибосома тРНК 1. SJ. Kolb, JT. Kissel Spinal Muscular Atrophy. A Timely Review. Arch Neurol Aug; 68(8)

CP Патогенез СМА

CP Prior TW and Russman BS. GeneReviews ® Изображение с изменениями заимствовано из: Swoboda KJ, et al. NEJM (18): Биосинтез полноценного белка SMN геном SMN 1 В гене 9 экзонов, но экзон 2 разбит на 2a и 2b 1 Нормальный полноразмерный белок SMN состоит из 294 аминокислот 1 Примечание: У людей обычно по одной копии SMN1 в каждой хромосоме, т.е. всего две копии. Однако около 5-8% людей имеют более одной копии SMN1 в хромосоме. 2 SMN1 SMN1 пре-мРНК SMN1 мРНК Нормальный полноразмерный белок SMN

CP Lunn MR and Wang CH. Lancet : : Изображение с изменениями заимствовано из: Swoboda KJ, et al. NEJM (18): SMN1 по сравнению с SMN2 SMN2 отличается от SMN1 на 5 нуклеотидов, включая молчащую замену C T в экзоне 7 1 Замена C T влияет на сплайсинг гена, что приводит к вырезанию экзона 7 из приблизительно 90% синтезируемого белка¹ Образующийся белок SMN нестабилен и быстро разрушается 1 SMN1SMN2 SMN1 пре-мРНК SMN1 мРНК Нормальный полноразмерный белок SMN Делеция в SMN1 SMN2 SMN2 пре-мРНК SMN2 мРНК Не образующий олигомеров, нестабильный укороченный белок SMN Быстрое разрушение

CP Дендриты собирают сигналы Аксон передает сигналы Миелин Мышечное волокно Нервно-мышечное соединение СМА, спинальная мышечная атрофия; SMN, белок выживаемости мотонейронов 1. CURE SMA, understanding SMA. По состоянию на июнь 2017 г.; 2 Lunn MR & Wang CH. Lancet. 2008;371: ; 3. Burghes AH & Beattie CE. Nat Rev Neurosci. 2009;10: ; 4. Tisdale S & Pellizzoni L. J Neurosci. 2015;35: ; 5. Todd AG, et al. J Mol Biol. 2010:401: http://goo.gl/HfUaDE SMN необходим для поддержания двигательных нейронов в спинном мозге Мотонейроны контролируют работу мышц, обеспечивающих выполнение таких функций как дыхание, ползание, ходьба, удержание и наклон головы, а также глотание. 1 SMN - это белок, который повсеместно экспрессируется во всех тканях, включая двигательные нейроны 2,3 Он также участвует в аксональном транспорте РНК в аксонах 2,4,5 Высокие уровни обнаружены в конусе роста двигательных нейронов и в постсинаптическом нервно-мышечном соединении 2. Недостаточный уровень SMN приводит к гибели клеток и дисфункции двигательных нейронов 3

CP Lunn MR and Wang CH. Lancet : : Fallini C, et al. Brain Res : Последствия недостаточности SMN для моторных нейронов У всех пациентов со СМА отсутствует ген SMN1, но есть как минимум одна копия гена SMN2 1 Небольшое количество полноразмерного белка SMN, синтезируемого с SMN2 (~ 10%), частично компенсирует отсутствие SMN1, позволяя функционировать большинству клеток 2. Однако для выживания двигательных нейронов такого количества белка SMN недостаточно, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости и атрофии 2. Изображение с изменениями заимствовано из: Marieb EN and Hoehn K. "Fundamentals of the Nervous System and Nervous Tissue." Норма Низкие уровни SMN

CP Патофизиологические признаки СМА SMA возникает как заболевание РНК, проявления которого не ограничены моторными нейронами, но связаны с дисфункцией моторных цепей, которые включают множество субпопуляций нейронов и других типов клеток СМА, спинальная мышечная атрофия; РНК, рибонуклеиновая кислота Farrar MA, et al. Ann Neurol. 2017;81: Сердце структурные дефекты вегетативная дисфункция Костная ткань моделирование смешанных костей Желудочно-кишечный тракт нарушения энтеральной нервной системы, функций желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы Дисфункция моторной сети дисфункция сенсорно-моторной цепи потеря альфа-мотонейронов Астроциты нарушения в образовании синапсов и синаптической передачи к двигательным нейронам Мотонейроны аномалии процессинга РНК нарушения аксонального наведения и транспорта Нервно-мышечное соединение аномальное строение нервно-мышечного соединения Мышца небольшие незрелые мышечные волокна денервация Кровеносные сосуды сосудистые дефекты спинного мозга и мышц, приводящие к гипоксии Шванновские клетки нарушения миелинизации Давайте уберем этого человечка. Доказательства системного влияния скудны и спорны

CP Генетика СМА

CP SMA является аутосомно-рецессивным заболеванием Дети Риск СМА Носитель СМА Родители Носитель СМА Носитель СМА 50 % Больной СМА 25 % Здоровый ребенок 25 % СМА - спинальная мышечная атрофия, SMN - белок выживаемости мотонейронов 1. Tisdale S & Pellizzoni L. J Neurosci. 2015;35: ; 2. Cure SMA. Understanding SMA. По состоянию на август 2016 г.; 3. dAmico A, et al. Orphanet J Rare Dis. 2011;6:71-81http://goo.gl/HfUaDE. По состоянию на август 2016 г.; 3. Носитель СМА: физическое лицо, имеющее одну нормальную копию SMN1 и одну поврежденную или удаленную копию SMN1 2 Приблизительно от 1/40 до 1/60 человек являются носителями СМА 3

CP СМА обусловлена гомозиготными мутациями в гене SMN1. СМА - спинальная мышечная атрофия, SMN - белок выживаемости мотонейронов 1. Brzustowicz LM, et al. Nature. 1990;344:540–541; 2. Melki J, et al. Nature. 1990;344: ; 3. Lunn MR & Wang CH. Lancet. 2008;371: ; 4. Wang CH, et al. Curr Treat Options Neurol. 2008;10: Гены SMN1 и SMN2 расположены на хромосоме 5q13.2 1,2. Последовательности генов SMN1 и SMN2 отличаются только на 5 нуклеотидов 3 У людей, как правило, имеется две копии SMN1 и переменное количество копий SMN2 4 SMN2 SMN1

CP Мутации в гене SMN1 приводят к снижению уровня белка SMN или к его отсутствию СМА - спинальная мышечная атрофия, SMN - белок выживаемости мотонейронов. 1. Lefebvre S, et al. Cell. 1995;80: ; 2. Prior TW, et al. Genet Med. 2011;13: ; 3. Farrar MA, et al. Ann Neurol. 2017;81: ; 4. Buchbach ME, et al. Front Mol Biosci. 2016;3:7. doi: /fmolb ; 5. Arnold WD, et al. Muscle Nerve. 2015;51: Наиболее распространенная аллель заболевания, присутствующая у 95% пациентов с СМА, несет делецию, приводящую к потере экзона Это обозначается "0-копия" или "0" аллель 2 мРНК без экзона 7 кодирует укороченный белок SMN, который быстро разрушается (SMNΔ7) 3, % транскриптов, образованных при транскрипции гена SMN2, включают экзон 7 и кодируют полноразмерный функциональный белок SMN 4 У пациентов с СМА это обеспечивает достижение уровня белка SMN достаточного для предотвращения летальности, но недостаточного для полной компенсации отсутствия SMN1 5 пре-мРНК СПЛАЙСИНГ ТРАНСЛЯЦИЯ Полноразмерная мРНК SMN мРНК без экзона 7 Белок Функциональный полноразмерный белок SMN Нефункциональны й укороченный белок SMN

CP СПИНРАЗА (нусинерсен) Механизм действия

CP Нусинерсен: Молекулярная структура АСО, антисмысловой олигонуклеотид 1. Ionis Pharmaceuticals. platform/medicinal- chemistry/. По состоянию на февраль 2016 г.; 2. Evers MM, et al. Adv Drug Deliv Rev. 2015;87:90-103http:// platform/medicinal- Нусинерсен представляет собой модифицированный 2-O-2- метоксиэтилфосфоротиоат антисмысловой олигонуклеотид (АСО) 1 АСО могут быть модифицированы для улучшения их характеристик по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами 2 Модификация 2'-O-метильной группы может улучшить аффинность связывания Модификация фосфоротиоатного остова может улучшить устойчивость к нуклеазам R = OCH 2 CH 2 OCH 3

CP Транскрипция АСО Модуляция функции РНК Изменение экспрессии белка Трансляция АСО, антисмысловой олигонуклеотид; GMP, good manufacturing practice (надлежащая производственная практика); мРНК, матричная РНК; НМЗ, нервно-мышечное заболевание; СМА, спинальная мышечная атрофия 1. Evers MM, et al. Adv Drug Deliv Rev. 2015;87:90-103; 2. Kole R, et al. Nat Rev Drug Discov. 2012;11: ; 3. Aartsma-Rus A & van Ommen GJ. Eur J Hum Genet. 2010;18: ; Терапия антисмысловым олигонуклеотидом (АСО) АСО - короткие синтетические цепи нуклеиновых кислот длиной 8–50 п.н. 1-3 Связываются с РНК по принципу комплиментарности 1 Могут быть сконструированы с целью связывания со специфической последовательностью мРНК 1-3 Гибридизация АСО/ мРНК модулирует функцию РНК и изменяет экспрессию белка 1-3 АСО обладают более благоприятными свойствами биораспределения, чем более крупные молекулы 3 Могут производиться в больших количествах в условиях GMP 3 мРНК

CP Механизм действия нусинерсена (1) СМА обусловлена мутациями (обычно гомозиготной делецией) в гене SMN1, что приводит к низкому уровню экспресии белка SMN1 Недостаточный уровень SMN приводит к дисфункции двигательных нейронов и развитию СМА 2 Небольшое количество белка SMN также вырабатывается при экспрессии гена SMN2. 2 Тем не менее: Приблизительно у 90% транскриптов гена SMN2 отсутствует экзон 7 1 мРНК SMN2 быстро разрушается и поэтому не может выполнять свою функцию 2 SMN1SMN2 C SMN1 пре-мРНК 678 SMN1 мРНК 678 Нормальный полноценный SMN-белок Не образующий олигомеров, нестабильный укороченный белок SMN SMN2 SMN2 пре-мРНК 678 SMN2Δ7 мРНК 68 T Быстрое разрушение ~90% АСО, антисмысловой олигонуклеотид; мРНК, матричная РНК; СМА, спинальная мышечная атрофия; SMN, белок выживаемости мотонейронов. 1. Lunn MR & Wang CH. Lancet. 2008;371: ; 2. Burghes AH & Beattie CE. Nat Rev Neurosci. 2009;10:

CP Нусинерсен механизм действия (2) SMN2 пре-мРНК Экзон 7 Экзон 8 Интрон 6 Замена C > T T ISS-N1 интрона 7 гяРНП гяРНП, гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин; ISS-N1; интронный сплайсинговый сайленсер-N1: мРНК, матричная РНК; SMN, белок выживаемости мотонейронов. 1. Corey DR. Nature Neurosci. 2017;20: ; 2. Rigo F, et al. J Cell Biol. 2012;199:21-25 Вырезанию экзона 7 из зрелой мРНК способствует: Замена C > T в экзоне 7 SMN2 1,2 Связывание гяРНП A1/2 с интронным сплайсинговым сайленсером-N1 (ISS-N1) в интроне 7 SMN2 2

CP Нусинерсен механизм действия (3) Нусинерсен увеличивает количество транскриптов гена SMN2, содержащих экзон 7, посредством: 1,2 Конкурирует с гяРНП A1/2 за связывание с сайтом ISS-N1 в интроне 7 Было показано, что нусинерсен увеличивает продукцию полноразмерных транскриптов мРНК и белка SMN как в мышиной модели СМА 3,4, так и у пациентов с СМА (измерено посмертно) 5 гяРНП A1/ Интрон Экзоны 53 Без АСО С АСО АСО 8 Интрон АСО, антисмысловой олигонуклеотид; гяРНП, гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин; ISS-N1; интронный сплайсинговый сайленсер-N1: мРНК, матричная РНК; SMN, белок выживаемости мотонейронов. 1. Rigo F, et al. J Cell Biol. 2012;199:21-25; 2. Corey DR. Nature Neurosci. 2017;20: ; 3. Hua Y, et al. Genes Dev. 2010;24: ; 4. Passini MA, et al. Sci Transl Med. 2011;3:ra18; 5. Finkel RS, et al. Lancet. 2016;388(10063):3017–3026 гяРНП A1/2 ISS-N1

CP АСО, связывающийся с SMN, способствует сплайсингу гена SMN2 Контроль Нусинерсен (50 мкг/сут) Белок SMN в тканях спинного мозга мышей SMN Мыши b-тубулин SMN /--/- 8 Полноценный SMN-белок Укороченный белок SMNΔ7 мг/сут Мыши % вкл. АСО - антисмысловой олигонуклеотид, SMN - белок выживаемости мотонейронов. Hua Y, et al. Genes Dev. 2010;24: Нусинерсен способствует сплайсингу SMN2 и повышает уровень продукции белка SMN в тканях спинного мозга мышей Нусинерсен 50 мкг/день Физ. раствор