CITOGENETICA – STUDIUL CROMOZOMILOR

CITOGENETICA – ŞTIINŢA DESPRE CROMOZOMI

CITOGENETICA METODE MODERNE DE STUDIEREA A CROMOZOMILOR: Metoda directă Metoda indirectă Metoda Bending. Eucromatina. Heterocromatina. Clasificarea cromozomilor umani Cariotiparea.Cariotipul normal şi patologic Cromatina X PLANUL LECŢIEI

Cromozomii – corpusculi compactaţi, intens spiralizaţi din nucleul celulei, constând din câte o moleculă de ADN, în care se păstrează înregistrată informaţia genetică ereditară a unui om.

CROMOZOMII UMANI – STRUCTURĂ ŞI NUMĂR Celulele tinere (inainte de faza de replicare a ADN) deţin o singură macromoleculă de ADN bicatenar, formând cromozomii monocromatidici. După faza S de replicare a ADN, cromozomii devin bicromatidici, posedând două macromolecule de ADN bicatenar. Cele două cromatide ale unui cromozom dispuse aproape paralel, sunt reunite in regiunea centromerului, regiune denumită şi constricţie primară.

Cromozomii sunt nişte corpusculi compactaţi, ce se găsesc constant în nucleul celulei, purtători ai informaţiei genetice ereditare a individului

Cromozomii prezintă o formă de inaltă compactare (condensare) a cromatinei în celulele pe cale de diviziune. Ei pot fi observaţi şi studiaţi la microscopul optic în metafază, aplicând tehnici de colorare şi bandare sau cercetaţi electronomicroscopic. Cercetând structura fină a cromozomului metafazic, se observă că el este format din două cromatide identice, fiecare cromatidă reprezentînd o moleculă de ADN. Cele două cromatide sunt unite la nivelul centromerului.

Cromozom monocromatidian Cromozomi bicromatidieni

Structura cromozomilor metafazici 2 cromatide unite printr-un centromer

Condensarea maximă a cromatinei este în cromozomii metafazici, în care materialul genetic este condensat de 9000 ori, diametrul e de 700nm şi se formează cromozomii metafazici.

a = molecula ADN; ø2nm b = nucleosom ø10nm c = fibra cromatina (solenoid) ø30nm d = bucle suprarasucite ø300nm e = zone condensate de cromozomi ø700nm f = cromozom metafazic ø1400nm

Cromozomul îndeplineşte trei funcţii principale: de replicator în timpul dublării informaţiei genetice; de transcriptor, prin care informaţia genetică este pusă la dispoziţia sistemului celular pentru sinteze proteice şi coordonare a activităţilor metabolice; de depozitar al informaţiei genetice, secvenţa nucleotidelor din macromolecula de ADN reprezentînd codificarea acestei informaţii genetice.

Cromozomii se studiază prin metode citogenetice : Cariotiparea Determinarea cromatinei X Determinarea cromozomului Y suplimentar prin microscopiere fluorescentă

Cei mai disponibili pentru cercetările citogenetice sunt cromozomii metafazici, deoarece ei sunt dispuşi într-un singur plan la ecuatorul celulei, formând placa metafazică, sunt maximal condensaţi, compactaţi, spiralizaţi, uşor se colorează şi sunt maximal vizibili la microscop.

de obţinere a cromozomilor metafazici se aplică în cazul necesităţii unui rezultat rapid, urgent şi constă în obţinerea unui grup de celule din măduva osoasă roşie prin puncţie sternală sau din călcâiul nou-născutului, din gonada masculină, din vilozităţile coriale, din tumori. Prin puncţie sternală din măduva osoasă roşie se extrage 0,25 – 1 ml de punctat în care oricând găsim celule în metafază. Metoda directă

de cultivare a celulelor. În acest caz se cercetează celulele sângelui periferic, recoltat din deget (leucocite, limfocite), fibroblaste din piele, celule amniotice, celule ale diferitor ţesuturi embrionare ale avortonilor. Obţinerea preparatelor cromozomiale se efectuează în câteve etape standard pentru toate tipurile de ţesuturi folosite în studiul citogenetic. Metoda indirectă

Metoda de obţinere a preparatelor cromozomiale din culturi de limfocite 1. Prelevarea sîngelui periferic: -macrometoda - se recoltează 5-10 ml de sânge venos; -semimicrometoda - se recoltează 1-2 ml de sânge venos într-o seringă heparinizată; -micrometoda - se prelevă cîteva picături de sânge din deget cu un capilar steril heparinizat. Cultura de limfocite este un tip de cultură în suspensie, în care celulele se multiplică liber în masa mediului de cultură. Limfocitele umane sînt capabile de activitate metodică după ore de cultură, la care se adaugă stimulatorului de mitoză fitohemaglutinina (o proteină vegetală extrasă din fasole) în prezenţa căreia limfocitele se înmulţesc activ. Celulele se cultivă la o temperatură de 37°C timp de 72 ore.

2. Colchicinizarea culturilor – în scopul blocării diviziunilor în metafază se adaugă soluţie de colchicină sau colcemid, care distruge fisul de diviziune.

3. Şocul hipotonic – la adăugarea soluţiei hipotonice are loc dilatarea celulelor şi dispersarea cromozomilor.

4. Fixarea celulelor – cu ajutorul fixatorului (alcool metilic + acid acetic glacial, 3:1) se întrerupe activitatea vitală a celulei, păstrând intactă morfologia acestora.

5. Etalarea celulelor – obţinerea plăcilor metafazice cu cromozomi bine dispersaţi şi cu o frecvenţă suficientă în acelaşi plan, fără suprapuneri.

6. Colorarea şi bandarea cromozomilor – Pentru colorarea uniformă a cromozomilor, diferenţierea şi individualizarea lor morfologică mai frecvent se foloseşte colorantul Romanovskii – Ghiemsa în metoda de rutină.

Analiza cariotipului în placa metafazică

Placa metafazică

7. Întocmirea şi unterpretarea cariotipului - În preparatele citologice pregătite se alege o placă metafazică şi se analizează cromozomii în cîteve etape: Analiza vizuală a preparatelor cromozomiale; Analiza cromozomilor prin desenarea plăcii metafazice; Analiza cromozomilor prin fotografiere şi aranjare pe grupe.

Centromerul împarte cromozomul în două: braţul lung (q) şi braţul scurt (p).şi are o pozitie variabila dar constantă pentru acelaşi cromozom. In funcţie de poziţia centromerului cromozomii pot fi: metacentrici când centromerul este localizat median iar cele două braţe sunt de lungimi aproape egale; submetacentrici când centromerul este plasat înafara regiunii mediane iar unul din braţe este mai lung decât celălalt acrocentrici când centromerul este plasat foarte aproape de unul din capete şi cromozomul apare format din două braţe inegale dintre care unul foarte lung şi altul foarte scurt.

Tipurile cromozomilor umani

Extremitatea fiecărui cromozom poartă numele de telomer. Telomerele joacă un rol esenţial în menţinerea stabilităţii şi integrităţii cromozomilor. La om, acestea sunt formate din mai multe secvenţe TTAGGG, repetate în tandem, care sunt menţinute de enzime denumite telomeraze. Se apreciază că reducerea nivelului telomerazelor asociată cu scăderea numărului de secvenţe TTAGGG joacă un rol important în procesele de îmbătrânire şi moarte celulară. Nucleul fiecărei celule somatice conţine două seturi de cromozomi, fiecare moştenit de la un părinte. Membrii unei perechi de cromozomi sunt numiţi cromozomi omologi. Materialul din care sunt formaţi cromozomii, ADN şi proteine histonice, poartă numele de cromatină. Gradul de condensare colorare a cromozomilor nu se realizează uniform. Acest lucru se observă mai ales în profază şi teleofază. Ca urmare se apreciază că cromatina prezintă două stări funcţionale alternative şi reversibile: eucromatina şi heterocromatina.

Cromozom uman submetacentric

Itemi cu alegere unică: Indică faza mitozei în care cromozomii sunt maximal disponibili pentru cercetare: 1.telofaza 2.metafaza 3.profaza 4.interfaza 5.anafaza

Cariograma masculină = 22 cromozomi autozomi şi 2 cromozomi sexuali XY

Cariograma feminină = 22 cromozomi autozomi şi 2 cromozomi sexuali XX

Cariograma multicoloră fluorescentă Tehnica SKY

Cariograma multicoloră fluorescentă

Cariogramă patologică în S. Down

Sindrom Patau sau trisomia cromozomului 13

Clasificarea cromozomilor umani

Cariotipul

Cariotipuri normale C = 46, XX C = 46, XY

Cariotipuri anormale Sindromul Turner 45,XO Trisomia cromoz-lor 21 – sindr.Down Sindromul Klinefelter 47,XXY 48,XXXY Sindromul Triplo-X 47,XXX superfemeie Sindromul Y suplimentar 47,XYY

Analizaţi cariotipurile C = 45,XO C = 47,XXY C = 48,XXXY C = 47,XXX C = 47,XYY

Itemi cu răspuns liber: Enumeră particularităţile cariotipului uman: a) ……………………………………. b) ……………………………………. c) …………………………………… d) ……………………………………. e)

Particularităţile cariotipului uman a) Se găseşte în nucleul unei singure celule somatice b) Constă din număr total de 46 cromozomi c) Diferă la bărbat şi femeie prin semnul genetic masculin şi feminin d) Diferă la bărbat şi femeie prin cromozomii sexuali masculini XY şi feminini XX e) În formulă se indică numărul total de cromozomi, apoi virgula, după care cromozomii sexuali

Metoda de bandare (bandarea Q, G, R, C, T) permite recunoaşterea exactă a tututror cromozomilor şi identificarea precisă a anomaliilor structurale fine. Cromozomii metafazici prezintă benzi, în timp ce cromozomii aflaţi în profaza timpurie prezintă benzi. Prin metode de bandare sau de obţinere de benzi pe cromozomi se pun în evidenţă sectoare slab colorate numite eucromatinice, care sînt genetic active, conţin gene funcţionale de pe care e posibilă transcripţia informaţiei genetice, precum şi sectoare intens colorate numite heterocromatinice, care sînt genetic pasive, fără capacitate de transcriere a informaţiei genetice. Metoda Bending

Prin tehnici speciale se pot identifica în cromozomi zone cu condensare diferită a cromatinei (eucromatină şi heterocromatină)- bandarea cromozomilor, cu rol în identificarea cromozomilor şi a mutaţiilor. Cromozomii umani

Schema cromozomului uman 10

CROMOZOMUL DROZOFILEI

O SECŢIUNE DIN CROMOZOMUL DROZOFILEI Se observă sectoare de culoare deschisă - eucromatinice şi de culoare închisă - heterocromatinice

METODE FISH

2.2. CROMATINA SEXUALĂ (v. LP ) CROMATINA SEXUALĂ - definiţie: CROMATINA SEXUALĂ - definiţie: corpuscul de HCRT un corpuscul de HCRT, morfologice bine definite cu particularităţi morfologice bine definite, NR cromozomilor sexuali care permite identificare NR cromozomilor sexuali sexului genetic - determinarea sexului genetic (XX sau XY); anomaliile cromozomilor sexuali - anomaliile cromozomilor sexuali (XO, XXX, XXY). cromatina X La femeie: cromatina X (corpusculul Barr) cromatina Y La bărbat: cromatina Y (corpusculul F) U.M.F IAŞI poziţie, mărime, formă alţi cromocentri Morfologie – v.LP = cromocentru

ORIGINEA CROMATINEI SEXUALE X CROMATINA X: CROMATINA X: inactivarea unui cromozom X corpusculul Barr rezultă prin inactivarea unui cromozom X (la femeile XX) va forma (prin heterocromatinizare) corpusculul Barr Ipoteza Lyon (1961): totală (1) inactivarea cromozomului X este totală ; ambele sexe un singur X activ. (corect = parţială* regiuni/gene active în ambii cromozomi X) precocedefinitivă (2) se produce precoce (i.u) şi este definitivă ; (posibil = uneori reversibilă) întâmplareindependent (3) are loc la întâmplare ( X M sau X P ) şi independent în fiecare celulă (posibil = uneori ne întâmplătoare)

Numărul c. Barr = suma cromozomilor X inactivi Numărul c. Barr = suma cromozomilor X inactivi (numărul cromozomilor X = nr. c. Barr + 1) U.M.F IAŞI

CROMATINA SEXUALĂ CROMATINA Y: CROMATINA Y: heterocromatina de pe 2/3 distale braţ lung reprezintă heterocromatina de pe 2/3 distale braţ lung cromozom Y cromozom Y (colorată cu flurocromi – ex., quinacrină – şi vizibilă la microscop UV ca un corpuscul fluorescent ) corpuscul F corpuscul F ) exclusiv la bărbaţi Nr. corpusculi F = nr. cromozomi Y ex., bărbaţii XYY au 2 corpusculi F

BIBLIOGARFIA 1.Caruzina I.P., coautori, Bazele geneticii, Chişinău, Lumina, Helevin N.V., Lobanov A. M., Kolesova O. F., Culegere de probleme la genetica generală şi medicală, Chişinău, Universitas, Movileanu V., Popa N., Genetica, Lucrări practice, Compendiu, Chişinău, Ştiinţa, Botnarciuc L., Genetica medicală, Compendiu, Polidanus SRL, Chişinău, 2010.