Выполнила магистрант 1 курса ИЕН группы М-БХ-18 Охотина Мария Михайловна Клонирование ДНК

Клонирование ДНК (клонирование генов) процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий. Клонирование связано с перемещением фрагмента ДНК от одного вектора к другому. Векторы в этом случае – небольшие кольцевые молекулы ДНК (плазмиды) или вирусы бактерий (фаги), в которых содержится генетическая информация, позволяющая реплицировать последовательность ДНК. Благодаря фундаментальным открытиям XIX-XX веков, а именно открытиям явления рестрикции и созданию первой рекомбинантной молекулы ДНК существует молекулярное клонирование.

История молекулярного клонирования начинается в 1972 г, когда впервые in vitro была получена рекомбинантная молекула ДНК из фрагментов разных ДНК. Вирусная ДНК SV40 и ДНК фага лямбда были объединены в лаборатории П.Берга (Станфордский университет, США). В 1973 г. Коэн и Бойер использовали для получения рекомбинантной ДНК плазмидную ДНК и получили первую гибридную плазмиду, которую можно ввести в бактериальные клетки и получить экспрессию чужеродной ДНК in vivo.

Универсального метода получения рекомбинантной ДНК не существует. Принцип метода соответствует схеме: - получают фрагменты ДНК из организма донора, которые могут содержать от одного до нескольких генов; - каждый из фрагментов лигируют с векторной ДНК с образованием рекомбинантной молекулы, векторная ДНК несет маркер устойчивости к антибиотику; - смесь рекомбинантных ДНК используют для трансформации в клетки реципиенты, где плазмида реплицируется и передается потомству; - рекомбинантные клетки отбирают на селективных средах; - если рекомбинантные клетки продуцируют белок, идентичный донорной ДНК, это является подтверждением молекулярного клонирования. Таким образом, стратегия молекулярного клонирования заключается в том, чтобы изолировать индивидуальный ген или гены из большого и сложного генома и «переселить» его (их) в маленький и очень простой геном.

Общая стратегия молекулярного клонирования Для клонирования генов может служить геномная ДНК, кДНК, которая синтезируется с помощью обратной транскриптазы на матрице РНК, амплифицированная ДНК, полученная с помощью полимеразной цепной реакции, а также синтетическая ДНК, синтезированная in vitro из нуклеотидов.

Присоединение ДНК к клонирующему вектору проводят с помощью ДНК лигазы. Процесс введения рекомбинантных векторов в клетки-хозяев называется трансфекцией. Трансфекция может осуществляться несколькими способами в зависимости от природы вектора: трансформацией, конъюгацией и трансдукцией гетерологичной ДНК. Хранение. Первичное клонирование ДНК обычно дает набор клонов, соответствующих полному геному. Такая смесь клонов, полученных в результате расщепления индивидуального генома, называется ДНК библиотекой или библиотекой генов. ДНК может храниться в виде клонов на векторах, каждый из которых при необходимости может быть востребован. Идентификация клона. Процедура направлена на поиск необходимого клона в смеси, иногда из тысяч клонированных фрагментов. Эта задача сложная, но существующая техника позволяет успешно провести идентификацию даже в случае очень больших геномов (иммунологический скрининг, пульс электрофорез, ДНК-гибридизация, ДНК-микрочипы, скрининг по активности белка).

Создание геномной библиотеки

Для создания векторов для переноса чужеродной ДНК используют плазмиды, бактериофаги и вирусы. Вектор должен обладать следующими характеристиками: обеспечивать репликацию чужеродного фрагмента ДНК, иметь уникальные сайты рестрикции и содержать генетический маркер для отбора рекомбинантных клонов. Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирующиеся молекулы ДНК, не способные к самостоятельному существованию вне клетки. Плазмиды обладают основными свойствами, позволяющими использовать их в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК: небольшой размер, наличие уникальных сайтов рестрикции для молекулярного клонирования и селективного маркера для идентификации реципиентных клеток. С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК размером до 10 кб.

Векторы на основе фага лямбда. ДНК фага лямбда - это линейная двухцепочечная молекула размером около п.о. с одноцепочечными 5-концами из 12 нуклеотидов. Их называют cos- концами (cos-сайтами), они взаимокомплементарны и могут спариваться друг с другом с образованием кольцевой молекулы. В зрелых вирионах ДНК находится в форме линейной молекулы, попадая в клетку, ДНК циклизуется по соs-сайтам и функционирует в кольцевой форме. Преимущество использования фага лямбда перед плазмидами в том, что можно клонировать до 20 кб чужеродной ДНК. Эффективность внедрения рекомбинантных фагов составляет 100% в отличие от трансформации, при которой эффективность внедрения ДНК составляет

Космиды – это плазмиды с cos-сайтами фага лямбда. Космиды могут амплифицироваться как плазмидный вектор в клетках E. coli и быть нагруженными до 40 кб чужеродной ДНК. В космидный вектор можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК (40 кб) по сравнению с плазмидным или фаговым вектором, поскольку собственная ДНК космидного вектора мала, около 10 кб и способна эффективно доставлять рекомбинантную ДНК с помощью фага лямбда. По этой причине космиды используют при клонировании геномной ДНК эукариот.

Фазмиды – это искусственные гибридные векторы, включающие ДНК фага и плазмиды. Фазмиды после встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, а в других как плазмиды. Исходно фазмида имеет размер до 30 кб. В ее состав входит до 70% генома фага, включая coscайты и ori- последовательность фага. Применение фазмидных векторов значительно упрощает процедуру получения и отбора рекомбинантных векторов, поскольку только рекомбинантные фазмиды образуют на бактериальном газоне фаговые бляшки. В отличие от космидной или фаговой векторных систем, фазмидный вектор существует в клетке в виде плазмиды, а клонотека хранится в виде суспензии гибридных фагов

Характеристики хозяев для векторов с чужеродной ДНК. Использование бактерий как хозяев для рекомбинантной ДНК требует выполнения ряда условий. Организм клеток хозяина должен иметь генотип, соответствующий эффективной репликации вектора. Оптимальными характеристиками хозяина являются: быстрый рост на недорогих средах, отсутствие патогенности, способность принять чужеродную ДНК и поддержание ее стабильности при культивировании. Бесспорным лидером при выборе штамма-хозяина являются бактерии E. coli.