Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова Кафедра Химии природных соединений Изучение связывания 6S РНК Rhodobacter sphaeroides с РНК полимеразой E.coli Лаборатория химии нуклеиновых кислот Научный руководитель: д.х.н. Е. А. Кубарева Вед. инженер Д. А. Елкина Работу выполнил: Н. А. Сулимов

В качестве объектов исследования выбраны хорошо охарактеризованные бактерии: Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides и Bacillus subtilis. Рис. 1. Chen J, Wassarman KM, Mol Cell

Рис. 2. Beckmann BM, Hoch PG, EMBO J Структурная перестройка 6S РНК B. subtilis

4 Сравнение структурной перестройки 6S РНК E. coli и B. subtilis Рис. 3. Beckmann BM, Hoch PG, EMBO J. 2012

5 Сравнение структурной перестройки 6S РНК E. coli и B. subtilis Рис. 4. Beckmann BM, Hoch PG, EMBO J. 2012

Цель работы: анализ механизма структурной перестройки 6S РНК, возникающей за счет синтеза молекул пРНК у R. sphaeroides. Рис. 5. Elkina D, Weber L, RNA Biol Поставленные задачи: получение 6S РНК R. sphaeroides с помощью Т7-транскрипции; (в качестве матриц для синтеза будут использованы соответствующие ПЦР-продукты, содержащие гены 6S РНК и Т7-промотор.) получение 5-( 32 P)-меченых 6S РНК R. Sphaeroides получение комплекса 6S РНК:РНКП синтез пРНК детектирование структурной перестройки 6S РНК 6 Цель работы и поставленные задачи

В отличие от ДНК-полимеразы т 7 РНК-полимераза не нуждается в праймере для инициации синтеза. Инициация происходит при связывании т 7 РНК-полимеразы со специфическими последовательностями ДНК – промоторами. 5-трифосфатная группа первого остатка в синтезируемой молекуле РНК не расщепляется с высвобождением PPi, а сохраняется на протяжении всего процесса транскрипции. 7

Концентрация A260/280A260/230 (нанодроп), нк/мкл(по гелю), нк/мкл #EP ,36652,002,42 #E2040S 7755,93012,092,53 #EP0111 (5-OH-G) 994,4698,61,952,41 #E2040S (5-OH-G) 5042,72172,032,40 Концентрация 6S РНК после Т7-транскрипции 8 Эксперимент: Реакционная смесь (общий объем 0,5 мл) содержала буфер Е, 15 мМ каждого NTP, 40 мкг линеаризованной плазмидной ДНК и 1 ед. акт./мл пирофосфат азы. Реакционную смесь инкубировали 5 мин при 37°C и добавляли 150 мкл 30 мМ раствора гуанозина в ТЕ-буфере, предварительно нагретого до 75°C (фин. конц. 9 мМ). Это позволяло получить транскрипты с 5'-ОН концевой группой для последующего введения 32 Р-метки. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл Т7 РНКП (ок. 40 ед. акт./мкл) и инкубировали 2 ч при 37°C. Затем добавляли вторую али квоту Т7 РНКП (10 мкл) и реакционную смесь инкубировали еще 2 ч при 37°C. Выделение целевых РНК проводили в 7%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину, с последующей визуализацией под УФ-светом.

Анализ чистоты 6S РНК после т 7 транскрипции 7% ПААГ, ТВЕ, 7М мочевина М – 1000 – 800 6S РНК 1 6S РНК 2 9 Bacteriophage T7 RNA Polymerase #EP0111 (6S РНК 1) HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit #E2040S (6S РНК 2) – 600 – 400 – 300 – 200 – 100 6S РНК 3 6S РНК 4 М – 1000 – 800 – 600 – 400 – 300 – 200 – 100 7% ПААГ, ТВЕ, 7М мочевина Bacteriophage T7 RNA Polymerase #EP0111 (5-OH-G) (6S РНК 3) HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit #E2040S (5-OH-G) (6S РНК 4) Thermo Scientific RiboRuler Low Range RNA Ladder #SM1831 (М)

Кинирование 5-OH модифицированной 6S RNA Т4 Полинуклеотидкиназа катализирует перенос гамма-фосфата от АТФ на 5-концевую ОН-группу ДНК, РНК, олигонуклеотидов или нуклеозид-3-монофосфатов (прямая реакция). Эта реакция обратимая. В присутствии АДФ полинуклеотидкиназа проявляет 5-фосфатазную активность и катализирует обмен фосфатными группами между 5-фосфорилированными полинуклеотидными цепями и АТФ (реакция обмена). 10 Т4 Полинуклеотидкиназа [32]