Методы молекулярной диагностики

Использование молекулярных методов привело к увеличению специфичности, чувствительности диагностики инфекционной и неинфекционной патологии. Применение молекулярных методов незаменимо в случае: отрицательных результатов диагностики классическими методами использования для диагностики образцов, взятых после антибиотикотерапии или на поздних стадиях болезни необходимости получения срочного диагностического результата диагностики инфекций, вызываемых некультивируемыми или «привередливыми» микроорганизмов

Молекулярно-генетические методы идентификации и типирования микроорганизмов основываются на: ИЗУЧЕНИИ РАЗЛИЧИЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ а) анализ плазмидного профиля. Используют для определения распространенности плазмид резистентности среди микроорганизмов в различных медицинских центрах. б) макро рестрикционный анализ. Используют для выявления видеовых и подвидеовых различий микроорганизмов. ДНК ГИБРИДИЗАЦИИ а) риботипирование. Используют для типирования микроорганизмов. Исследуемую ДНК нарезают рестриктазами на фрагменты, которые разделяются электрофорезом и переносят на мембрану. К фиксированным ДНК-фрагментам добавляют ДНК-зонды - 16S или (и) 23S рРНК опероны изучаемого вида микроорганизмов, меченые хемоколориметрической или хемилюминесцентной системой; в результате образуются легко выявляемые комплексы. б) ДНК гибридизация. Используют для идентификации и типирования микроорганизмов. Меченые синтетические олигонуклеотиды зонды известной специфичности вступают в гибридизацию с изучаемой ДНК с образованием флюоресцирующих дуплексов. в) гибридизационные биочипы.

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В настоящее время существует огромное множество модификаций классической ПЦР, которые расширяют ее диагностические возможности: а) Классическая ПЦР. б) ПЦР с обратной транскрипцией. Используют для изучения РНК содержащих вирусов. При помощи обратной транскриптазы на РНК синтезируется копия ДНК – кДНК, которую амплифицируют в стандартной ПЦР. в) Гнездовая ПЦР. Разработана для увеличения чувствительности, специфичности реакции, позволяет определять нуклеиновые кислоты, присутствующие в очень низкой концентрации. ПЦР проводят последовательно с двумя разными парами праймеров. ДНК продукты, образуемые в первой ПЦР, способны взаимодействовать со второй парой праймеров. г) Мультипраймерная ПЦР. Одновременное использование нескольких пар праймеров позволяет приводить амплификацию нескольких генетических детерминант, что сокращает время и расход реактивов. д) ПЦР в реальном времени. Используют для определения точечных мутаций в ДНК и количественного содержания ДНК в пробе, а также определения экспрессии генов.

Сферы использования молекулярно-генетических методов в микробиологии : Диагностика инфекционных заболеваний. Маркёром возбудителя является его геном, а именно видеоспецифические генетические участки, по которым определяют присутствие определенного вида микроорганизма в клиническом материале Химиотерапия и химиопрофилактика инфекционных заболеваний. Молекулярно-генетические методы широко используются для выявления маркеров резистентности генов резистентности либо мутаций в генах. Санитарная микробиология. Молекулярно-генетические методы позволяют выявлять инфекционные агенты в пищевых продуктах и тем самым контролировать их качество или расследовать причину пищевых отравлений. Эти методы позволяют определять генетически модифицированные пищевые продукты, а также проводить детекцию инфекционных агентов в окружающей среде. Эпидемиология и инфекционный контроль. С помощью молекулярно-генетических методов определяют различия микроорганизмов одного вида (типируют микроорганизмы), выделенных от разных больных, в разных стационарах, в разных географических регионах. Это позволяет определять источники возбудителя, пути его распространения в стационаре, стране, мире и разрабатывать меры, контролирующие распространение эпидемических клонов. Биотехнология, в том числе вакционология. С помощью молекулярно-генетических методов создают генетически модифицированные организмы с полезными для народного хозяйства свойствами. Систематика и эволюция микроорганизмов. Молекулярно-гене-тические методы позволяют создать естественную систематику микроорганизмов, отражающую их эволюционные взаимосвязи. Геномика и патогеномика. При помощи молекулярно-генетичес-ких методов расшифровывают структуры и функций геномов, протеомов, внутриклеточных метаболитов, изучают молекулярный патогенез инфекционных заболеваний

Молекулярная гибридизация молекулярно- биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси. Методы молекулярной гибридизации позволяют выявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.

Варианты проведения молекулярной гибридизации : В растворе.

В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.

На микрочипах (эррей-гибридизация) наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.

На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию.

Этапы реакции гибридизации на мембранах: Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК (не более 5000– п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране: дот-блоты или слот-блоты. Перед нанесением ДНК денатурируют, превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты) либо полосок (слот-блоты); саузерн-блоты. Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран. Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 80 ºС или УФ-светом.

Гибридизация проводится в несколько этапов: обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны; приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд; программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 65 ºС.

Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана в 1983 г. американским биохимиком Кэри Мюллисом, который в 1993 г. был удостоен за это открытие Нобелевской премии. Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК и заключается в получении множественных копий (ампликонов) ДНК размером до 5000 п. о. В качестве амплифицируемых участков ДНК микроорганизмов могут выступать гены патогенности, жизненно важных функций (гены «домашнего хозяйства»), устойчивости к противомикробным препаратам, видео- и родоспецифичные гены (важны для идентификации).

Принцип ПЦР. После температурной денатурации двухцепочечной ДНК образуются одноцепочечные молекулы, к которым присоединяются небольшие олигонуклеотиды праймеры. Праймеры присоединяются только к комплементарному участку ДНК на обоих цепях ДНК и ограничивают амплифицируемый фрагмент с двух сторон. К 3'концу праймера прикрепляется ДНК-полимераза и на ДНК-матрице синтезирует копию. Синтез ДНК протекает только между праймерами Каждая стадия происходит при определенной температуре

Постановка ПЦР проводится в 5 этапов. Первый этап выделение (экстракция) ДНК из клеток (рис. 6). Метод выделения ДНК зависит от изучаемого микроорганизма и вида материала для исследований. На этой стадии клетки лизируют одним из способов: а) ферментативно (лизоцим); б) химически; в) термически (90–95 ºС). Клеточный дебрис осаждают центрифугированием, при этом ДНК остается в растворе.

Второй этап приготовление реакционной смеси. В микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 или 0,2 мл смешивают компоненты реакционной смеси так, чтобы объем общей реакционной смеси составлял 25, 50 или 100 мкл. Все компоненты реакции вносят микропипеткой, причём каждый раз наконечник микропипетки меняют во избежание контаминации. Обязательные компоненты реакционной смеси: а) раствор искомой ДНК, выделенной на предыдущей стадии; б) смесь четырёх дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов) строительный материал ДНК; в) термостабильная ДНК-полимераза Taq-полимераза (не денатурирует при 96 ºС), осуществляющая полимеризацию нуклеотидов; ее получают из термофильных микроорганизмов Termophilus aquaticus; г) два синтетических праймера (прямой и обратный) короткие, длиной 15–30 оснований, одноцепочечные олигонуклеотиды, которые связываются с комплементарными структурами исследуемой ДНК и с которых начинается биосинтез множественных копий; д) специфический буфер. Для функционирования Taq- полимеразы необходимы ионы Mg+2, определённые значение рН и концентрации солей.

Третий этап программирование температурного цикла и проведение амплификации заданного фрагмента ДНК в термоциклере На выделенной ДНК-матрице происходит процесс многократного копирования ДНК в ходе последовательно сменяющихся циклов. Пробирки с реакционной смесью размещают в приборе термоциклере. Температурные режимы циклов в термоциклере изменяются в соответствии с заданной программой. Программа проведения ПЦР включает 4 стадии

Стадия Темп, º С Экспозиция Описание стадии Начальная денатурация мин Большие двухцепочечные молекулы ДНК раскручиваются с образованием одноцепочечных молекул 25–40 циклов денатурация 90–95 25 с – 1 мин Небольшие двухцепочечные ампликоны раскручиваются с образованием одноцепочечных молекул отжиг 48–6525 с – 4 мин Праймеры прикрепляются к комплементарным фрагментам ДНК-матрицы, образуя дуплексы элонгация 7225 с – 4 мин ДНК полимераза прикрепляется к 3-концу праймера, соединившегося с ДНК-матрицей, и синтезирует копию, комплементарную ДНК- матрице Конечная элонгация 725–10 мин Образуются дуплексы ДНК Хранение 4––

Проведение электрофореза

Агарозный гель (0,5–4 %) с лунками для образцов опускают в аппарат для проведения электрофореза так, чтобы лунки находились в области катода. В камеру для электрофореза заливают трис-ацетат-ЭДТА- буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем составляла 1–2 мм. Образец смешивают с загрузочным красителем в соотношении 1:6 и вносят 6–20 мкл в лунку в геле. Обычно одновременно исследуют много образцов. Загрузочный краситель (зеленый, синий) имеет скорость движения, схожую с ДНК, поэтому по его перемещению судят о местонахождении ДНК в геле. В зависимости от плотности тока время проведения электрофореза составляет от 30 мин до 24 ч. После проведения электрофореза гель вынимают из камеры и переносят на столик трансиллюминатора, где бромистый этидий, связавшийся с ДНК, флюоресцирует в УФ-свете (230 нм), давая оранжевое свечение.

Пятый этап анализ и интерпретация результатов реакции (рис. 10). Для оценки результатов учитывают опытные лунки, а также лунки с положительным и отрицательным контролем

При интерпретации результатов ПЦР следует помнить, что могут быть получены как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Ложноположительные результаты могут наблюдаться в результате контаминации при нарушении правил проведения ПЦР. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться в результате снижения чувствительности ПЦР при ингибировании реакции компонентами биологических образцов. Преимущества метода пцр Чувствительность достигает г, (что составляет несколько копий инфекционного агента на пробу объемом 0,2 мл) Специфичность Возможность диагностики латентных вирусных инфекций Возможность обнаружения агрегированного возбудителя Возможность дифференциации видеов возбудителей Возможность быстрого выявления возбудителя

Спасибо за внимание