Колориметрические (фотометрические) методы ХМ Василевский В.В.

Основной закон колориметрии: закон Бугера-Ламберта-Беера Методы анализа, основанные на сравнении интенсивности окрасок исследуемого раствора и раствора определенной концентрации - стандартного, называются колориметрическими (колориметрией). Различают визуальную колориметрию, осуществляемую при помощи глаза наблюдателя, и фотоэлектрическую колориметрию, осуществляемую при помощи фотоэлемента. Если пропустить через слой раствора пучок света с интенсивностью I 0, то после прохождения через этот слой интенсивность света уменьшится до I t. Уравнение основного закона колориметрии - закона Бугера-Ламберта-Беера - имеет следующий вид: где I t - интенсивность светового потока после прохождения через раствор концентрацией С и толщиной слоя L; I 0 - интенсивность падающего светового потока; г - коэффициент, зависящий от длины волны падающего света, природы растворенного вещества и температуры раствора; коэффициент г называют молярным коэффициентом погашения.

Отношение интенсивности светового потока, прошедшего через раствор I t к интенсивности падающего светового потока I 0 называется пропусканием, или прозрачностью, и обозначается буквой T: Величина Т, отнесенная к толщине слоя в 1 см, называется коэффициентом пропускания. Логарифм величины, обратной пропусканию, носит название погашения (экстинкции) Е, или оптической плотности D (к примеру D=4 означает, что свет был ослаблен в 10^4= раз, то есть для человека это полностью чёрный объект, а D=0 означает, что свет прошёл полностью):

Следовательно, погашение Е прямо пропорционально концентрации вещества в растворе. Если графически изобразить зависимость погашения от концентрации, откладывая по оси абсцисс концентрацию, а по оси ординат - погашение, то получим прямую линию, идущую от начала координат (рис. 52). Такой график дает возможность сделать заключение о применимости к исследуемым растворам основного закона колориметрии. Если раствор подчиняется этому закону, то график, выражающий зависимость погашения; от концентрации, будет представлен прямой линией. Если раствор этому закону не подчиняется, то прямолинейность нарушается на каком-то участке кривой или на всей ее длине.

Колориметрические методы В основе этих методов лежит измерение при помощи визуального или фотоэлектрического колориметра окрашенного продукта, образующегося при взаимодействии субстрата или продукта действия фермента со специфическими реактивами, которые обычно добавляются в фиксированную опытную пробу, взятую после остановки ферментативной реакции. Эти методы весьма разнообразны. Разработаны количественные методы, основанные на биуретовой реакции, при которой состав белка, очевидно, не должен сказываться на результатах определения, т.к. эта реакция на пептидные связи, а не на боковые группы в белке.

Колориметрический метод по ГОСТ Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы. Амилолитическая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы и выражается числом единиц указанных ферментов в одном грамме препарата. За единицу активности амилолитических ферментов принято такое число, которое в строго определённых условиях температуры, рН и времени действия катализирует до декстринов различной молекулярной массы 1 г растворимого крахмала или 30 % от введённого в реакцию вещества. Полученные растворы приобретают следующую окраску: контрольный – синюю, опытный – фиолетовую различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала. Непосредственно после смешивания растворов определяют их оптическую плотность на фотоэлектроколориметре, используя светофильтр с максимумом светопропускания при λ=656 нм, пользуясь кюветами с толщиной поглощаемого свет слоя 1 см. Контрольным раствором при колориметрировании исследуемых растворов является дистиллированная вода.

Колориметрический метод по ГОСТ Оптическая плотность контрольного раствора D1 соответствует количеству исходного крахмала субстрата. Оптическая плотность опытного раствора D2 соответствует количеству крахмала, оставшегося после действия фермента. Разница между показателями оптических плотностей растворов соответствует гидролизованному количеству крахмала субстрата. Количество гидролизованного крахмала С (г) определяют по формуле: C=(0,1x(D1-D2))/n, где 0,1-количество крахмала, взятого в качестве субстрата, г. Если количество гидролизованного крахмала меньше 0,02 или больше 0,07 г, то испытания повторяют. Для этого при приготовлении рабочего раствора фермента берут большее или меньшее количество исходного раствора для разбавления. Если в результате ферментативной реакции количество превращённого крахмала находится в указанных пределах, полученные данные используют для расчёта амилолитической активности или скорости гидролиза. Обработка результатов. Амилолитическую активность АС (ед/мл) препаратов бактериального происхождения определяют по формуле: AC=((5,885xC+0,001671)x1000)/n, а амилолитическую активность препаратов грибного происхождения – по формуле: AC=((7,264xC-0,03766)x100)/n, где 5,885; 0,001671; 7,624; 0,03766 – коэффициенты расчётного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости количества гидролизованного крахмала от количества фермента, взятого для испытания (в коэффициенты введён множитель для пересчёта на 1 час действия фермента); С – количество прогидролизованного крахмала, г; 100; 1000 – коэффициент пересчёта миллиграммов в граммы; n – количество ферментного препарата, взятое для испытания, мг.

УФ-спектр при фотометрии В некоторых методах используют сопряженную ферментативную реакцию с участием кофермента НАДН или НАДФН, которые имеют максимум поглощения в УФ области при 340 нм, в то же время их окислфенная форма, образующаяся в результате реакции (НАД+ или НАДФ+), при этой длине волны не поглощает (рис. 9). На этом принципе основаны методы для определения активности АЛТ, АСТ, ЛДГ, альдолазы, креатинкиназы.

Приборная база Фотометры фотоэлектрические КФК-3-01 с рабочим спектральным интервалом от 315 до 990 нм используются для измерения спектрального коэффициента направленного пропускания (СКНП) в диапазоне от 1 до 99, оптической плотности (от 0,004 до 2 Б), скорости измерения оптической плотности. После специальной градуировки фотометра возможно измерение концентрации веществ в растворах (диапазон показаний от 0,001 до 9999).

Литература Г.Е. Яковлева. Ферменты в клинической биохимии. – Новосибирск: «Вектор-Бест», – 44 с. Демьянцева Е.Ю., Копнина Р.А. Ферментативный катализ в ЦБП: учебно - методическое пособие/СПбГТУРП. СПб., – 47 с. Г. И. Фертман, М. И. Шойхет Технохимический контроль бродильных производств Издательство "Пищевая промышленность", 1969 YouTube-канал KhanAcademyRussian, Введение в спектрофотометрию, Опубликовано: 30 сент г.