МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ

Энергетический обмен (катаболизм) Окислительный = дыхание Бродильный = ферментативный Смешанный

Окислительный метаболизм (дыхание) Дыхание – процесс получение энергии в реакциях окисления-восстановления, соп- ряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донорами электронов могут быть органические (у ор- ганоштрафов) и неорганические у (лито- штрафов) соединения, а акцептором – только неорганические соединения

Окислительный метаболизм (дыхание) Если акцептором электронов является молекулярный кислород, то это АЭРОБЫ Если акцептором электронов является нитрат или сульфат, то это АНАЭРОБЫ Нитратное дыхание встречается у факультативных анаэробов Бактерии, имеющие сульфатное дыхание (Desulfovibrio и Desulfotomaculum ) медицинского значения не имеют

Отношение бактерий к кислороду Облигатные анаэробы – не используют кислород для получения энергии. Тип метаболизма – бродильный (исключение: Desulfovibrio и Desulfotomaculum) Строгие анаэробы. Кислород для них токсичен. Энергию получают маслянокислым брожением (например, C.botulinum, C.tetani) Аэротолерантные - не используют кислород для получения энергии, но могут существовать в его атмосфере (молочнокислые бактерии)

Различное физиологическое отношение микроорганизмов к кислороду связано с наличием у них ферментных систем, позволяющих существовать в атмосфере кислорода. Для нейтрализации токсичных форм кислорода микроорганизмы, способные существовать в его атмосфере, имеют: супероксиддисмутазу, пероксидазу, каталазу.

Облигатные аэробы и факультативные анаэробы имеют супероксиддисмутазу и каталазу Аэротолерантные микроорганизмы не имеют супероксиддисмутазы, ее функцию выполняет высокая концентрация солей марганца. Перекись водорода у этих микроорганизмов разрушается пероксидазой Строгие анаэробы не имеют ни пероксидазы, ни каталазы, но супероксиддисмутаза встречается у многих анаэробов и коррелирует с их устойчивостью к кислороду

Супероксиддисмутаза расщепляет за- кисный радикал на перекись водорода и молекулярный кислород. Перекись водорода может расщепляться каталазой (облигатные аэробы и факультативные анаэробы) или пероксидазой (аэротолерантные микроорганизмы).

Бродильный (ферментативный) метаболизм Ферментация (брожение) – процесс получения энергии, при котором отщеплен- ный от субстрата водород переносится на органические соединения Кислород в процессе брожения участия не принимает. Восстановленные органические соединения выделяются в питательную среду и накапливаются в ней. Продуктами брожения являются кислоты, газы, спирты.

Типы брожений Исходя из природы конечных продуктов, различают несколько типов ферментации углеводов: Спиртовое Молочнокислое Муравьинокислое Маслянокислое Если для бактерий с бродильным метаболизмом источником энергии служат белки, то такие бактерии называются пектолитическими (C.histolyticum, C.botulinum)

Методы создания анаэробных условий Физические Химические Биологические

Физические методы создания анаэробных условий 1. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят их регенерацию путем кипячения в течение минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением да 45-50°С. После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином. 2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в пробирки в объеме мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов 3.Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азот, аргон, гелий) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80% азота, 10% двуокиси углерода и 10% водорода. В ряде случаев используют природный (магистральный газ). Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси используют палладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата помещают 5-6 г хлористого кальция, г силикагеля или г хлористого натрия.

Химические методы создания анаэробных условий 1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода из 220 мл воздуха применяют смесь, состоящую из 1 мл 20% раствора пирогаллола и 1 мл насыщенного раствора карбоната натрия 2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл свежеприготовленного 20% раствора Na 2 SО 4 и 16% КОН. Эти реагенты связывают кислород быстрее, чем пирогаллол 3. Для связывания остатков кислорода в предназначенный для роста анаэробов питательных средах используют вещества - редуценты, к которым относятся тиогликат натрия (0,01-0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1-3%), цистин и цистеин (0,03-0,05%), муравьино-кислый натрий (0,25-0,75%) и др. 4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пакетах). Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.

Биологические методы создания анаэробных условий 1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). При этом на одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроорганизма, способного активно поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру «чудесной палочки» (Serratia marcescens). При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии. 2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта-Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SН-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием. 3. Культуры некоторых облигатных анаэробов можно поддерживать путем пассажа на лабораторных животных.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов 1. Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэробные условия и выдерживают в термостате при 37°С в течение ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта-Тароцци. 2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора NaCl, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды. Выросшие через ч в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта-Тароцци или СКС. 3. Метод Вейона-Виньяля. Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром. Из каждой пробирки разведенный материал насасывают в пастеровские пипетки, после чего запаивают их концы. После получения микробного роста пипетку надпиливают в соответствующем месте, разламывают с соблюдением правил стерильности и переносят изолированную колонию в среду Китта-Тароцци или СКС.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов 4. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стеклянная пластинка размером 6Χ6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолированную колонию засевают в пробирку со средой Китта- Тароцци или СКС для получения чистой культуры. Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод «перевернутых чашек». При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином. Термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.

Питательные среды для выделения анаэробов Среда Китта-Тароцци. Бычью печень или мясо нарезают мелкими кусочками, заливают троекратным количеством питательного бульона рН 7,2 – 7,6, кипятят 30 мин. Бульон фильтруют. Печень промывают на сите водой, распределяют в пробирки по 3-4 кусочка в каждую, заливают 7-8 мл бульона (содержит 0,5 % глюкозы). Бульон кипятят 20 мин на водяной бане. Сверху на поверхность среды наливают стерильное масло слоем 1-1,5 см. Среда Вильсона-Блера. 100 мл 3% МПА с 1% глюкозы расплавляют на водяной бане, добавляют 10 мл 20% натрия сульфита и 1 мл 8 % раствора железа хлорида. Среда Виллиса-Хоббса. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 г лактозы, 1,8 мл нейтирального красного. После стерилизации добавляют 15 мл суспензии куриного желтка с физиологическим раствором и 60 мл стерильного обезжиренного молока.