ГЕНОМНЫЕ БИБЛИОТЕКИ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ИХ СОЗДАНИЯ

«БИБЛИОТЕКА» Библиотека набор клонов, каждый из которых содержит векторную молекулу различных фрагментов ДНК, производных от общей ДНК или РНК клеток или ткани. Если коллекция клонов достаточно велика, теоретически она должна содержать всю последовательность оригинальной ДНК. Затем можно идентифицировать в библиотеке клон, несущий интересующий фрагмент ДНК, используя чувствительные скрининговые методы, способные обнаружить его в коллекции из миллионов различных фрагментов, называемой «библиотекой».

Геномная библиотека представляет собой набор ДНК всего генома одного организма. Эта ДНК хранится в популяции идентичных векторов, каждый из которых содержит различные вставки ДНК. Т.е. это банк генов еще можно назвать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока. Первую геномную библиотеку создали Т. Маниатис с сотрудниками : ДНК из генома D. melanogaster клонировали в клетках E.coli

Для построения геномной библиотеки ДНК экстрагируют из клеток и затем расщепляют рестриктазой, чтобы разрезать ДНК на фрагменты определённого размера. Фрагменты затем встраивают в вектор с помощью фермента ДНК- лигазы. Далее вектор ДНК может быть встроен в организм- хозяин обычно в популяцию кишечной палочки (E. coli) или дрожжей, где в каждой клетке содержатся копии вектора с одной, уникальной вставкой.

Схема блоттинга колоний геномной библиотеки с последующей гибридизацией ДНК колоний и меченых ДНК-зондов

Один из способов получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами. Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.

ДЛЯ СОЗДАНИЯ БАНКА ГЕНОВ НЕОБХОДИМО 1)выделение всей геномной ДНК 2)фрагментация ДНК рестриктазами или ультразвуком 3) Очищенные кольцевые молекулы ДНК (векторы) обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК 4)рекДНК вводят в бактериальные или дрожжевые клетки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий. 5)Клонирование бактерий: каждая возникшая колония клеток представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид образует библиотеку геномной ДНК.

«+» И «-» Недостаток: фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же иностранные последовательности Достоинство : библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ: -источник трансгенов -источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков -сохранение генофонда исчезающих видов

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: а а klonirovanie-dnk-in-vivo.html klonirovanie-dnk-in-vivo.html