Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого» Институт медицинского образования Иммунофлюоресцентный анализ Выполнили: студенты группы 6324 Салманов Иса Хабибулаевич. Великий Новгород 2017 г.

Иммунофлюоресцентный анализ. Один из наиболее чувствительных методов выявления связывания антител с антигенами в клетках и тканях иммунофлюоресцентный анализ. Специальный флюоресцентный краситель (флюорохром) прикрепляется химической связью к молекуле специфического антитела, не нарушая его специфичности. Часто используют краситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто-зеленой флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлю- оресцентного метода, активируются светом одной длины волны (чаще ультрафиолетовой части спектра), а сами испускают лучи другой длины волны (видимого спектра). В люминесцентном микроскопе используется в качестве источника света, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его называют методом экспресс- диагностики.

Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических антител против каждого из изучаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой иммунофлюоресцентный метод, при котором связанные с антигеном специфические антитела (немеченые) выявляются с помощью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген- специфические антитела.

Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент (например, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разложения, видимые в обычный световой микроскоп.

Для использования при электронной микроскопии антиген- специфические антитела можно метить частицами золота, локализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов

Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечивая его свечение при люминесцентной микроскопии.

На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связывающихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!