Применение иммунного блоттинга в диагностике цитомегаловирусной инфекции 1 г. Москва, 2016 Авдонина А.С.

Актуальность проблемы цитомегаловирусной инфекции Цитомегаловирус (ЦМВ) один из самых частых спутников человека. В развитых странах к 50 годам 5080 % населения являются серопозитивными по ЦМВ ЦМВ передается множеством способов: контактный, воздушно-капельный, фекально-оральный, половой, вертикальный, парэнтеральный, ятрогенный (при переливаниях крови и трансплантации) ЦМВ в результате перенесенной острой инфекции не элиминируется, а переходит в латентное состояние, в котором он удерживается сформированным иммунитетом. 2

Методы лабораторной диагностики ЦМВИ Цитологические (Окраска препаратов азур-эозином, гематоксилин-эозином или по Папенгейму с обнаружением характерного совиного глаза) Вирусологические (метод культуры клеток) Молекулярно-генетические (ПЦР) Серологические (РСК, РИФ, ИФА, иммуноблот) 3

Алгоритм серологической диагностики ЦМВИ 4

Иммуноблот как подтверждающий и дифференцирующий тест Определение антител к отдельным антигенам вируса Полный спектр выявляемых клинически значимых антигенов Подтверждение результатов скрининга Дифференциация стадии инфекции Дифференциация ЦМВИ от других герпесвирусных инфекций Доступность и простота в использовании 5

Количество определений: 24, возможна дробная постановка по 6 определений Комплект 1 - «ИФА-Блот-ЦМВ-IgM» Комплект 2 - «ИФА-Блот-ЦМВ-IgG» Срок годности: 1 год Двухстадийный, качественный анализ Образец для анализа: сыворотка, плазма крови- 20 мкл Время проведения анализа 1 ч 10 мин Правильность выполнения теста оценивается с помощью контрольной линии (Кр) (антитела против IgG человека) Температура инкубации 18-25°С использованием шейкера-качалки Адаптирован под анализатор «ИФА-БЛОТ-ЦМВ-IgM/IgG» Набор реагентов для выявления антител классов M и G к индивидуальным белкам цитомегаловируса человека методом иммунного блоттинга, формат «WESTERN BLOT». 6

Культивирование цитомегаловируса и получение лизатного антигена Питательная среда «ИГЛА МЕМ» Культура клеток фибробластов человека Штамм CMV «AD-169», ф.«ATCC» 7

Антигенный состав полученного лизата Высоко специфичные антигены: - рр 150, фосфопротеин оболочки вируса, продукт гена UL32; - рр 130, неструктурный фосфопротеин, продукт гена UL57; - pр 28, фосфопротеин тегумента капсида, продукт гена UL99 Низко специфичные антигены: - gр 75, гликопротеин H (антиген gH), продукт гена UL82 - gр 55, гликопротеин В (антиген ДВ), продукт гена UL55; - рp 52, ДНК-связывающий фосфопротеин, продукт гена UL44; - p 38, структурный фосфопротеин, продукт гена UL38 Перекрестно-реагирующий антиген: - pр 65, фосфопротеин тегумента, продукт гена UL83 рp130 рp150 gp75 рp65 рp52 gp55 p38 рp28 Контрольная линия 8

Интерпретация результатов теста Класс Свойства Антигены 1Перекрестно-реагирующие pр 65 2Низко специфичные др 75, gр 55, рp 52, p 38 3 Высоко специфичные р р 150, рр 130, pр 28 Результат Описание Положительный Как минимум одна полоса класса 3, плюс несколько полос класса 1 и 2. Неопределенный Слабая полоса класса 3 или более чем одна полоса класса 2. Отрицательный Отсутствие полос. Одна полоса класса 1 или одна слабая полоса класса 2. 9

Клиническая интерпретация результатов лабораторных исследований Стадия развития заболевания Выявляемые маркеры Антитела класса IgM (ИФА) Антитела класса IgG (ИФА) Антигены (нРИФ) Антитела к отдельным антигенам (иммуноблот) Нет встречи с возбудителем ---- Встреча с возбудителем в прошлом -+ (высокоавидные) - рp130, gр 75, рр 65, gр 55, р 38 Острая инфекция начало +-+/- рр 65, рр 52, рр 28 (IgM) разгар ++ (низкоавидные) + рр 65, рр 52, рр 28 конец +/-+ (высокоавидные) +/- рp150, рp130, gр 75, рр 65, gр 55, рp52, р 38, рp28 Латентная инфекция -+ (высокоавидные, редко низкоавидные) +/- рp150, рp130, gр 75, рр 65, gр 55, рp52, р 38, рp28 Реактивация (хроническая инфекция в стадии обострения) ++ (низкоавидные) + рp150, рp130, gр 75, рр 65, gр 55, рp52 -+ (высокоавидные) + рp150, рp130, gр 75, рр 65, gр 55, рp52, р 38, рp28 10

Оценка чувствительности и специфичности Исследование на сыворотках стандартной панели "Стандарт АТ-G (+/-) ЦМВ" ф. «МБС» Чувствительность – 100% Специфичность – 100% Сравнение с аналогом "Anti-CMV WESTERBLOT" фирмы Euroimmun AG (Германия) 11

Исследование сывороток панели «Anti-CMV Mixed Titer Performance Panel PT C203», Sera Care Life Sciences, USA образцаSeraCare (скрин) «ИФА-ЦМВ- IgG» (скрин) ф. ЗАО «ЭКОлаб» «ИФА-Блот-ЦМВ-IgG» ф. ЗАО «ЭКОлаб» PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, gp55, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, р 38) PTC положит (рр 130, gp75, р 38) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, рр 65, gp55, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130,gp75,рр 65, gp55,рр 52,р 38,рр 28) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, gp55, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, рр 65, р 38) PTC положит (рр 130,gp75,рр 65, gp55,рр 52,р 38,рр 28) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, gp55, рр 52, р 38) PTC положит (рр 130, рр 65, рр 52) PTC положит (рр 130, рр 65, рр 52) PTC положит (рр 130, gp75, рр 65, рр 52, р 38) PTC отриц PTC положит (рр 130, рр 65) Комплект 2 «ИФА-Блот-ЦМВ-IgG» 12

Исследование сывороток панели «Anti-CMV Mixed Titer Performance Panel PT C203», Sera Care Life Sciences, USA образцаSeraCare (скрин) «ИФА-ЦМВ- IgМ» (скрин) ф. ЗАО «ЭКОлаб» «ИФА-Блот-ЦМВ-IgМ» ф. ЗАО «ЭКОлаб» PTC ,71,2 положит (рр 130, рр 65, gp55, р 38) PTC ,11,1 положит (рр 130, рр 65, рр 52) PTC ,20,02 отриц PTC ,80,8 положит (рр 130, рр 65, р 38) PTC ,10,03 отриц PTC ,50,03 отриц PTC ,10,05 отриц PTC ,90,06 отриц PTC ,30,05 отриц PTC ,10,01 отриц PTC ,10,01 отриц PTC ,51,9 положит (рр 130, рр 65, рр 52) PTC ,01,1 положит (рр 130, рр 65, рр 28) PTC ,40,07 отриц PTC ,01,3 положит (рр 130,рр 65, рр 52) PTC ,60,04 отриц PTC ,71,0 положит (рр 130, рр 65, рр 52) PTC ,10,07 отриц PTC ,41,3 положит (рр 130, рр 65, gp55, рр 52, р 38) PTC ,20,02 отриц PTC ,40,07 отриц Комплект 1 «ИФА-Блот-ЦМВ-IgМ» 13

Исследование образцов с сомнительным результатом в отношении ЦМВИ в иммуноблоте (тест-система «ИФА-Блот-ЦМВ-IgM/IgG» ф. ЗАО "ЭКОлаб") Результаты иммуноблота Тип образцов Количество образцов Отрица- тельные Неопреде- ленные Положи- тельные Сомнительные по наличию IgG в ИФА 5500 Сомнительные по наличию IgM в ИФА

142530, Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1 Отдел маркетинга: тел./факс: +7 (496)