Использование методов ДНК- диагностики в медицине Исабаева М.Ш.

- была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кери Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК- полимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science. Через 8 лет после этого за изобретение метода ПЦР Кэри Муллис получил Нобелевскую премию. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР лежит в основе ДНК-диагностики любых наследственных заболеваний. С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК.

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов. Материалом для проведения исследований методом ПЦР служат, как правило, биологические жидкости и выделения организма: кровь, моча, слюна, мокрота. Прежде чем сдать анализ ПЦР, необходимо проконсультироваться со специалистом и тщательно подготовиться к процедуре. Анализ крови для исследования методом ПЦР берется обычно натощак.

Наследственные болезни - ЭТО БОЛЕЗНИ,ОБУСЛОВЛЕННЫЕ НАРУШЕНИЯМИ В ПРОЦЕССАХ ХРАНЕНИЯ, ПЕРЕДАЧИ И РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ. Моногенные (менделирующие болезни, когда заболевание определяется одним главным геном) Хромосомные болезни (геномные и хромосомные мутации) Мультифакториальные (обусловлены многими генами и факторами среды) - Аутосомно-доминантные: синдром Марфана; болезнь фон Виллебранда; анемия Минковского- Шоффара и др - Аутосомно-рецессивные: фенилкетонурия; галактоземия; муковисцидоз и др. - Х-сцепленные рецессивные: гемофилия А и B; миопатия Дюшена; и др. - Х-сцепленные доминантные: витамин D- резистентный рахит; коричневая окраска эмали зубов и др. - ЦНС: некоторые формы эпилепсии, шизофрения и др. - Сердечно-сосудистой системы: ревматизм, гипертоническая болезнь, атеросклероз и др. - Кожи: атопический дерматит, псориаз и др. - Дыхательной системы: бронхиальная астма, аллергический альвеолит и др. - Мочевой системы: мочекаменная болезнь, энурез и др. - Пищеварительной системы: язвенная болезнь, неспецифический язвенный колит и др.

Моногенные болезни Разнообразие моногенных заболеваний достаточно велико и их количество по некоторым данным достигает С клинической точки зрения это очень разные, достаточно тяжелые болезни. Причиной каждого из этих заболеваний является повреждение или мутация одного гена. Следствием мутации может быть нарушение структуры или синтеза кодируемого геном белка, часто сопровождающиеся изменением его количественного содержания вплоть до полного отсутствия. Мутации могут передаваться из поколения в поколение, но порой могут возникать в половых клетках родителей спонтанно. Большинство мутаций, ассоциированных с моногенными заболеваниями, жестко детерминируют развитие болезни, и факторы окружающей среды не оказывают или оказывают небольшое влияние на развитие заболевания. Среди моногенных болезней значительный процент составляют ферментопатии, различные формы умственной отсталости, дефекты органов слуха, зрения, скелетные дисплазии, врожденные пороки развития, болезни нервной, эндокринной, соединительно-тканной, иммунной и других систем.

Мультифакториальные болезни обусловлены комбинированным действием неблагоприятных внешних и генетических факторов риска, формирующих наследственную предрасположенность к заболеванию. К мультифакториальным заболеваниям относятся подавляющее большинство хронических болезней человека, сердечно- сосудистые, эндокринные, иммунные, нервно-психические, онкологические и др. заболевания.

Способы выявления наследственных заболеваний Цитогенетические позволяют исследовать под микроскопом с использованием различных специфических окрасок тонкую организацию хромосом человека и ее нарушения, которые приводят к появлению хромосомных болезней. Биохимические Некоторые из наследственных болезней характеризуются выраженными биохимическими изменениями, которые связаны с нарушениями определенного метаболического пути. Эта группа заболеваний объединена в особый класс, называемый наследственные нарушения обмена веществ (НБО). Диагностика НБО включает качественный и количественный анализ различных метаболитов в образцах биологических жидкостей, определение активности ферментов в культуре клеток или лейкоцитах периферической крови. Многие из этих исследований довольно сложные и проводятся с помощью таких высокотехнологичных методов как высокоэффективная жидкостная хроматография, хроматомасс-спектрометрия, тандемная масс-спектрометрия и т.д. Синдромологические Большинство наследственных заболеваний характеризуется поражением многих органов и систем и разнообразной клинической симптоматикой. Задача врача-генетика заключается в том, чтобы, используя имеющиеся у него специальные знания о проявлении наследственных болезней, и, детально обследовав больного и членов его семьи, постараться поставить диагноз наследственного синдрома. Во многих случаях врач пользуется для этого специальной литературой и компьютерными программами, которые содержат описания и фотографии больных с различными наследственными синдромами. Молекулярно-генетические Молекулярно-генетические методы это самые современные методы исследования генетического материала клеток человека, который представлен дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК) кислотами.

Молекулярно-генетический метод основан на анализе нуклеиновых кислот, в первую очередь, молекул ДНК. Основной целью этих методов является диагностика мутаций, исследование их ассоциации с наследственными заболеваниями, а также выявление гетерозиготных и гомозиготных носителей мутации. Внедрению молекулярно-генетической методологии в клиническую практику способствовала разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) или специфической амплификации ДНК.

ДНК - диагностика Изучает непосредственную причину заболевания Наиболее адекватная и точная диагностика Возможна даже в тех случаях, когда неизвестен ген, ответственный за заболевание

Типы ДНК- диагностики ПРЯМАЯ Определение мутации, являющейся непосредственной причиной болезни КОСВЕННАЯ Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе

Прямая ДНК-диагностика Основу прямой диагностики составляет идентификация мутаций в самом гене. Преимущества метода: -100%-ная точность -возможна при сомнительном диагнозе -возможна при полилокусном заболевании -возможна безпробандная диагностика Недостатки метода: - Необходимо знание структуры гена - Информативна не для всей семьи

Косвенная ДНК-диагностика О снована на анализе внутри- и внегенных полиморфных сайтов. В качестве последних обычно выступают короткие ДНК- последовательности одних и тех же гомологичных участков хромосом, различающихся по первичной структуре. Эти диагностические полиморфные сайты могут располагаться либо внутри самого гена, либо в непосредственной близости от него. Преимущества метода: + не требуется знание гена и спектра мутаций в нем + информативна практически для всей семьи + абсолютная уверенность в клиническом диагнозе Недостатки метода: - Точность 95-99% - Обязательно наличие одного локуса заболевания - Обязательно проведение семейного анализа

Методы прямой ДНК-диагностики: Количественная флюоресцентная ПЦР. Real-time ПЦР. Анализ кривой плавления MLPA – анализ (количественная лигазная реакция) Ресеквенирование

Количественная флуоресцентная ПЦР (QF PCR) Анализ дозы гена Анализ экспрессии генов Метод флуоресцентной количественной полимеразной цепной реакции (quantitative Fluorescent PCR – QF-PCR) заключается в амплификации коротких тандемных повторов ДНК (STR), расположенных на исследуемой хромосоме или сцепленных с исследуемым геном. Использование в ПЦР специальной флуоресцентной метки позволяет идентифицировать количество аллелей STR-маркеров при разделении на капиллярном электрофорезе и точно определять дозу каждого фрагмента ДНК гена или хромосомы, для этого в реакционную смесь добавляют специфический флюоресцентный зонд и далее через циклов определяют уровень флюоресценции. Интерпретация результатов проводится с учетом количества пиков на электрофореграмме и их относительной высоты.

Real-time ПЦР Анализ дозы гена (делеции/дупликации) Определение точковых замен Анализ экспрессии генов - онкологические исследования - трисомии - анализ плодного материала по кровотоку матери - генотерапия

Real-time ПЦР это группа методик, дающих возможность качественного анализа продуктов ПЦР в режиме реального времени по ходу проведения реакции. Основными этапами данного метода являются: Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации. Построение по этим данным кинетической кривой PCR. Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой. Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР- продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы ее генерации различаются в зависимости от конкретного типа real-time PCR.

Пример использования аллель-специфической ПЦР-РВ для диагностики мутаций. Слева – гетерозигота (соотношение нормального и мутантного аллеля 1:1) Справа – нормальная гомозигота (отмечается поздняя неспецифическая амплификация мутантного аллеля)

Анализ кривой плавления - Позволяет провести оценку качества реакции, поскольку увеличение флюоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). - Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флюоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флюоресценция резко снижается. Температура плавления зависит от нуклеотидного состава, поэтому путем сравнения кривых плавления изучаемых образцов с таковыми в образцах, имеющих известную последовательность, можно выявить кандидатов на дальнейшее секвенирование. Стрелкой показана кривая плавления образца с мутацией; С – мутация TSC1c.1525C>T; D – нормальная нуклеотидная последовательность TSC1

MLPA – анализ (мультиплексная амплификация лигазно-связаных проб) Определение числа копий фрагмента (дозы гена) - Носительство Х-сцепленных делеций для женщин - Аутосомные делеции/дупликации - Микроделеционные синдромы - Анеуплоидии - Определение числа копий гена/псевдогена Анализ однонуклеотидных замен (SNP) На первом этапе анализа производится денатурация ДНК и ее гибридизация со специфичными пробами (зондами). Зонды расположены очень близко друг от друга, к одному из их концов присоединена последовательность для прикрепления универсального праймера. На следующем этапе происходит специфичное лигирование проб с помощью фермента лигазы. Далее производится мультиплексная ПЦР- амплификация с использованием универсальных праймеров; при этом многократно увеличивается только количество лигированных фрагментов. Продукты амплификации, имеющие разные размеры, сепарирубтся посредством капиллярного электрофореза. Наличие пика и его высота на электрофореграмме отражает состояние данного генетического локуса (норма, делеция или дупликация).

Применяется в диагностике микроделеционных синдромов (синдром 22q11, синдром Вильямса и т. д.) и во многих ситуациях является более доступной альтернативой FISH.

Ресеквенирование - Повторное секвенирование генома с целью выявления разнообразных структурных вариаций (однонуклеотидных полиморфизмов, или «снипов», а также инсерций, делеций, повторов, инверсий, транслокаций). В отличие от секвенирования неизвестных последовательностей de novo, при котором прочтения соотносятся друг с другом и собираются в контиги, для ре- секвенирования достаточно просто «картировать» прочтения на референсную последовательность, уже имеющуюся под рукой. Снипы выглядят как однонуклеотидные замены в коротких прочтениях, при этом количество прочтений с заменой говорит о состоянии аллеля гомозиготном (все прочтения с заменой) или гетерозиготном (половина прочтений с заменой).

Заключение Заключение, полученное с помощью ДНК-диагностики, дает оценку вероятности возникновения заболеваний, ассоциированных с теми или иными мутациями/полиморфизмами и профилактические и лечебно-диагностические рекомендации для пациента и лечащего врача. Проведенные исследования показали, что у 5,3% людей в возрасте до 25 лет разовьются болезни, обусловленные наследственными факторами, а в течение жизни у 60% людей разовьются болезни, связанные с наследственной предрасположенностью. Ограничение современных возможностей лечения наследственных заболеваний и непредсказуемый характер передачи генов от поколения к поколению заставляют сосредоточить внимание на профилактике, как на наиболее надежном и эффективном способе предотвращения этих болезней. Знание степени вероятности возникновения полигенных болезней позволяет снизить величину риска развития заболевания в результате лечения до развития необратимых поражений, поскольку наличие тех или иных полиморфизмов не приводит с неизбежностью к болезни.

Благодарю за внимание!