Генетически детерминированная дифференцировка прогениторных клеток под воздействием GDNF Группа: Нейрогенетики и генетики развития Научный руководитель: д.б.н.Павлова Г.В г. Аспирант: Канайкина Н.Н.

Цель: Исследование воздействия GDNF на дифференцировку первичных клеточных культур и линейных клеток, использование данного фактора при трансплантациях в мозг модельных животных с целью снижения глиального рубца и улучшения приживаемости трансплантата.

Задачи (2009): 1. Создать модельную систему для изучения стволовых клеток, трансфицированных генами человека (на примере GDNF) под контролем хит-шокового промотора гена дрозофилы hsp70 2. Изучить влияние полученных конструкции на стволовые клетки с последующей возможностью использования промотора hsp 70 в качестве управляющего элемента трансгенов 3. Создать генно-инженерных конструкций (векторов), содержащих промотор hsp70 дрозофилы, меченный флуоресцентным белком EGFP. Провести молекулярно-генетический анализ. 4. Ввести методом трансфекции данных конструкций в линию клеток HEK293, проанализировать их экспрессию в культуре 5. Получить культуру клеток линии НЕК293, экспрессирующих химерный белок GDNF-EGFP, под контролем hsp Анализ экспрессии GDNF в различных отделах мозга крыс. (линии Крушинского -Молодкиной)

Индуктор-рекомбинантный белок GDNF. Nestin in HASC,notinduced GDNF, during 1 week. Control IIITUB in HASC, induced GDNF,during 1 week. IIITUB in HASC, notinduced GDNF, during 1 week. Control Nestin in HASC,induced GDNF, during 1 week Eno2 in HASC, induced GDNF, during 1 week. Eno2 in HASC, induced GDNF, during 1 week. Control

Получение генномодифицированной линии HEK293, содержащей гены gdnf/gfp. К Нозерн-блот гибридизация линии эмбриональных почечных клеток человека (НЕК293) трансфекцированных геном GDNF/GFP. К- контроль (исходные HEK293) Вестерн-блот гибридизация. 1-лизат клеток линии НЕК293, трансфицированных pEGFP-N1,2-лизат клеток линии НЕК293 GDNF/GFP. Цифрами отмечены молекулярные массы белков, входящих в состав маркера. Изменение фенотипа трансфицированной клеточной культуры НЕК293, содержащей ген gdnf опыт контроль Изменение фенотипа трансфицированной клеточной культуры НЕК293, клеточной культуры НЕК293, содержащей ген gdnf

1. Генно-инженерные конструкции (вектора) Hsp70 EGFP - В7 вектор ( содержащий hsp upstream region + EGFP) hsp upstream Hsp70 EGFP hsp upstream pEGFP-N1 -F7 вектор ( содержащий hsp upstream region + EGFP) Gtcgacggatccccgacaccagaccaactggtaatggtagcgaccggcgctcagctggaattaggccttctagaccgcggccgcagatctgttaacga attcccaattccCTATTCAGAGTTCTCTTCTTGTATTCAATAATTACTTCTTGGCAGATTTCAGTAGTTGCAGTTG ATTTACTTGGTTGCTGGTTACTTTTAATTGATTCACTTTAACTTGCACTTTACTGCAGATTGTTTAGCTTGTT CAGCTGCGCTTGTTTATTTGCTTAGCTTTCGCTTAGCGACGTGTTCACTTTGCTTGTTTGAATTGAATTGTC GCTCCGTAGACGAAGCGCTCTATTTATACTCCGGCGCTCTTTTCGCGAACATTCGAGGCGCGCTCTCTCG AACCAACGAGAGCAGTATGCCGTTTACTGTGTGACAGAGTGAGAGAGCATTAGTGCAGAGAGGGAGACC CAAAAAGAAAAGAGAGAATAACGAATAACGGCCAGAGAAATTTCTCGAGTTTTCTTCTGCCAAACAAATGA CCTACCACAATAACCAGTTTGTTTTGGGATTCTAgggggatcggggatcaattctagtatgtatgtaagttaataaaacccttttttggag aatgtagatttaaaaaaacatattttttttttattttttactgcactggatatcattgaacttatctgatcagttttaaatttacttcgatccaagggtatttgaagtaccagg ttctttcgattacctctcactcaaaatgacattccactcaaagtcagcgctgtttgcctccttctctgtccacagaaatatcgccgtctctttcgccgctgcgtccgcta tctctttcgccaccgtttgtagcgttacctagcgtcaatgtccgccttcagttgcactttgtcagcggtttcgtgacgaagctccaagcggtttacgccatcaattaaa cacaaagtgctgtgccaaaactcctctcgcttcttatttttgtttgttttttgagtgattggggtggtgattggttttgggtgggtaagcaggggaaagtgtgaaaaatc ccggcaatgggccaagaggatcaggagctattaattcgcg neoR Праймeры (5-3): phsRtaacgaattcccaattccctattcag phs1F gatcaagcttgttcaatgatatccagtgc phs5F cccaaagcttggatttttcacactttcccc

В7 вектор ( содержащий hsp upstream region + EGFP) НЕК 293 на просвет НЕК 293 после 42 0 С 48 часов после трансфекции F7 вектор ( содержащий hsp upstream region + EGFP) PCR с геномной ДНК НЕК293 с праймерами на GFP 1-маркер 2-В7 3-F7 4-HEK293 не транчфецированные Western-blot c Anb GFP po\Rab 1-HEK293+gfp (СМV промотор) 2-4 НЕК293 +В7 5-6 НЕК+F7 7- НЕК Работа с полученными векторами В7 и F7 Линия клеток НЕК 293 после трансфекции Селекция клеток на G418 (Sigma) Экспрессия белка GFP Конт.(-) 7% B7 40C (24 ч) 10,5% B7 40C (48 ч) 3% B7 42C (24 ч) 8,2% B7 42C (48 ч) 23,4% F7 40C (24 ч) 23,2% F7 40C (48 ч) 22,1% F7 42C (24 ч) 49,9% F7 42C (48 ч) 47,4%

2. Генно-инженерные конструкции Hsp70 EGFP hsp upstream pEGFP-N1 hGDNF Hsp70 EGFP hsp upstream pEGFP-N1 hGDNF - В7 / GDNF Fusion ( содержащий hsp upstream region +GDNF- EGFP) neoR - F7/ GDNF Fusion ( содержащий hsp upstream region +GDNF- EGFP) Ccttaatcgagaaagtcgganaggccagaggggcaaaaaccggggttgtgtcttaactgcaatacatttaaatgtcactgacttgggtctgggctat gaaaccaaggaggaactgatttttaggtactgcagcggctcttgcgatgcagctgagacaacgtacgacaaaatattgaaaaacttatccagaaata gaaggctggtgagtgacaaagtagggcaggcatgttgcagacccatcgcctttgatgatgacctgtcgtttttagatgataacctggtttaccatattct aagaaagcattccgctaaaaggtgtggatgtatctgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgc ccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccc tgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccg accacatgaagcngcncgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaag acccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatccctgng ggcacaagctggaagtacaactacaacagccaacaacgtctattatcatggccgacaaagcaaaaagaacggcattcaaggtgaaactttcaagat ccgcc Праймеры: Gdnf-BamHI 5-tggatcccagatacatccacaccttttagcgg-3 T3 5- attaaccctcactaaaggga-3

В7 / GDNF Fusion ( содержащий hsp upstream region +GDNF- EGFP) Линия клеток НЕК 293 после трансфекции Работа с полученными конструкциями В7/GDNF и F7/GDNF НЕК 293 после 42 о С 48 часов после трансфекции НЕК 293 на просвет F7/ GDNF Fusion ( содержащий hsp upstream region +GDNF- EGFP) PCR с геномной ДНК НЕК293 Праймеры: GDNFf-GFPr 1-100bp Руллер 2-НЕК НЕК293/GFP 4-HEK293/B7-GDNF-GFP 5-HEK293/F7-GDNF-GFP Экспрессия белка GFP Контр. 5,1% B7/GDNF 40C (24 ч) 30,3% B7/GDNF 40C (48 ч) 82,2% B7/GDNF 42C (24 ч) 25% green B7/GDNF 42C (48 ч) 63% red F7/GDNF 40C (24 ч) 43% F7/GDNF 40C (48 ч) 51% F7/GDNF 42C (24 ч) 32% green F7/GDNF 42C (48 ч) 53% red B7/GDNF 42 о C F7/GDNF 42 о C

CMV GDNF neoR 1. CMV GDNF neoR EGFP FLAG (DYKDDDDDK) Hsp70 hsp70 pEGFP-N1 hGDNF neoR +100 upstream flag Hsp70 hsp70 pEGFP-N1 hGDNF neoR +500 upstream flag pEGFP-N1 hGDNF neoR flag CMV PL4

Экспериментальная модель: Tubulin Крысы инбредной линии Крушинского-Молодкиной(КМ) GDNF (B8) SantaCruz a b a b a b a b kDa 50kDa а- опыт белковый экстракт мозга крыс КМ b-контроль белковый экстракт мозга крыс (0) Цифрами отображены различные отделы головного мозга крыс 1-область больших полушарий 2-височная доля коры больших полушарий 3-обонятельные луковицы 4-мозжечок 5-ствол 6-промежуточный мозг 7-продолговатый мозг 8-нижние бугорки четыреххолмия Иммуногистохимический анализ срезов опытной и экспериментальной линии животных Экстракт белка различных отделов головного мозга экспериментальных животных Western-Bloot анализ распределение GDNF в мозге крысы

Выводы: 1. Разработана система для изучения стволовых клеток, трансфицированных генами человека (на примере GDNF) под контролем хит-шокового промотора гена дрозофилы hsp70 2. Изучены особенности работы данных векторов в культуре клеток НЕК Клонированы конструкции, в которых химерный ген GDNF-GFP, находится под контролем промотора гена дрозофилы hsp70 4. Предприняты попытки выведения клеточной линии НЕК293, содержащие изучаемый ген GDNF, под контролем промотора hsp70. Однако экспериментальные данные говорят о неустойчивости данной клеточной линии в течении долгого периода, связанной с неэффективной экспрессией белка GFP (возможно из-за его неправильной конформации) 5. Предложены несколько вариантов решения этих трудностей: -Использование мечение изучаемого гена более коротким маркером flag, с последующим обнаружением гена GDNF при помощи антител к данной аминокислотной последовательности -Работа с лентевирусным вектором для достижения поставленной цели, а также для увеличения процента клеток, содержащих в своем составе ген GDNF 6. Проделаны первоначальные эксперименты на животных, интересующей нас линии КМ, которые имеют припадки после включения звука. Выявлены различия экспрессии белка GDNF в различных отделах головного мозга крыс.Разрабатывается экспериментальная модель для трансплантации этих животных, как трансгенными клеточными линиями, содержащих ген GDNF, так и непосредственной трансплантации плазмидной ДНК.

Научные конференции: Биотехнология: состояние и перспективы развития, март 2009 г., г. Москва Биотехнология: состояние и перспективы развития, март 2009 г., г. Москва Всероссийский симпозиум: Культивируемые клетки как основа клеточных технологий, октябрь 2009 г., г.Санкт-Петербург Всероссийский симпозиум: Культивируемые клетки как основа клеточных технологий, октябрь 2009 г., г.Санкт-Петербург 34th FEBS congress, июль 2009 г, Чехия 34th FEBS congress, июль 2009 г, Чехия 2nd International conference on Dug Discovery and Therapy, февраль 2010 г., Дубаи 2nd International conference on Dug Discovery and Therapy, февраль 2010 г., Дубаи

Методы: 1. Методы клонирования: - приготовления компетентных клеток - трансформация E.coli - выделение плазмидной ДНК (в разном объеме) - лигирование - рестрикция 2. PCR анализ 3.Wester-bloot 4.Блот-гибридизация по Саузерну 5. Работа с культурой клеток: - получение первичной культуры (MNSC) - ведение выведенных линий клеток(на примере Phoenix, HEK293, C6) - Трансфекция. Электропорация 6. Иммуногистохимия

Трудности: Линия HEK293, трансфецированная конструкциями с составом химерного белка GDNF-GFP является неустойчивой: после 3-х кратного температурного активирования промотора, исчезает экспрессия белка ЕGFP. Однако линия остаеться устойчивой к селекции на G418 (к гену резистенции в составе полученных конструкций)… Линия HEK293, трансфецированная конструкциями с составом химерного белка GDNF-GFP является неустойчивой: после 3-х кратного температурного активирования промотора, исчезает экспрессия белка ЕGFP. Однако линия остаеться устойчивой к селекции на G418 (к гену резистенции в составе полученных конструкций)…

Праймеры, которые использовались в работе: Название Последовательность (5-3) XbaI-gdnfF tctagaatgaagttatgggatgtc XhoI-gfpnRctcgagttacttgtacagctcgt Gdnf- flagBamHI cggatcctacttgtcgtcatcgtctttgtagtcgatacatccacacctttt agc T3attaaccctcactaaaggga Gdnf-BamHItggatcccagatacatccacaccttttagcgg Gdnf-Raatgctttcttagaatatggt Gdnf-Fggaatcggcaggctgcagctg phsRtaacgaattcccaattccctattcag phs1Fgatcaagcttgttcaatgatatccagtgc phs5Fcccaaagcttggatttttcacactttcccc egpFcgtcagatccgctagcgctaccgg egpRaataaagcttgcatggcggtaatacg hseqRgcgcagctgaacaagctaaac PL4tcgcctggagacgccatcca