«Метод Секвенирования» Подготовила: Усенбаева Диана Группа: 121 «Б»

Сожержание Секвенирование биополимеров История Секвенирование по Сэнгеру Этапы Секвенирования Геном человека Общие характеристики генома человека Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту Автоматическое секвенирование ДНК Методы секвенирования нового поколения Литература

Секвенирование биополимеров это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК (от лат. sequentum последовательность)

В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком. Все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» её в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности.

История К концу 60-х годов XX века Ф.Сэнгером был разработан метод секвенирования РНК, получаемой с ДНК-матрицы при помощи РНК-полимеразы. В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца.

Секвенирование по Сэнгеру Первым методом секвенирования, который учёные сумели применить для обработки целых геномов (в том числе генома человека), стало секвенирование по Сэнгеру (Sanger sequencing). Смысл таков: участок ДНК клонируется, после чего полученная смесь делится на четыре части. Каждая часть помещается в активную среду, где присутствуют: (1) ДНК-полимераза, которая занимается репликацией, (2) праймеры, необходимые для начала процесса репликации, (3) смесь всех четырёх нуклеотидов, которые будут служить «кирпичиками» для строительства новых копий ДНК, (4) и специальные вариации одного из нуклеотидов (ровно один вид нуклеотидов для каждой части), которые прекращают дальнейшее копирование молекулы ДНК. Именно при помощи сэнгеровского секвенирования был впервые расшифрован геном человека.

Раствор с праймером распределяют по четырём пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них меченный радиоактивным изотопом) и один из четырёх 2',3'- дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырёх пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

Этапы Секвенирования Секвенирование происходит в 3 этапа: 1. Выделение геномной ДНК, прочтение и создание библиотеки фрагментов; 2. Сборка; 3. Аннотация и анализ.

Для секвенирования необходимы количества порядка молекул Главное знать размер полученных фрагментов, например, по методу дробовика. Полученные прочитанные фрагменты надо собрать в исходную последовательность. Исходная цепь восстанавливается благодаря тому, что у фрагментов, полученных от разных цепей, есть общие перекрывающиеся части. Для начала, из этих фрагментов нужно создать библиотеку набор из последовательностей длиной в 2–3 тыс. нуклеотидов. Для хорошего сигнала во время секвенирования, надо много одинаковой ДНК в про- бирке. Копии фрагментов получают путем их клонирования.

Секвенировать неизвестную последовательность можно двумя способами: можно отщеплять по одному нуклеотиду и определять каждый, но нужно следить, чтобы не отщеплялось по нескольку букв. можно достраивать цепь ДНК. Сейчас более распространен второй метод. Для него в реакционную смесь добавляют нуклеозид-трифосфаты (dNTP) и фермент, который будет по правилу комплементарности достраивать вторую цепь на матричной ДНК. Особенность метода в том, что в реакционную смесь добавляют дидезоксинуклеотиды (ddNTP: ddA, ddT, ddG, ddC). Если такой нуклеотид встроится в ДНК, то синтез цепи терминируется. И так как дидезоксинуклеотиды встраиваются полимеразой случайно, в результате получится набор цепей ДНК разных длин.

Геном человека Программа по секвенированию генома человека стартовала в 1990 году, это обошлось в 3,5 млрд USD. Методика заключалась в том, что сначала поделили хромосомы, потом сами хромосомы порезали на фрагменты по 10 тыс. п. н., их клонировали в одних бактериях, очистили один фрагмент от другого и раздробили на еще более мелкие куски, которые затем снова клонировали в E.coli, выделили, прочитали и склеили друг с другом. Крейг Вентер автор метода дробовика. Он считал, что не нужно кучу раз пересевать и клонировать куски ДНК, а можно просто разбить сразу на куски и потом их собрать. Крейг Вентер с помощью придуманного им метода занимался секвенированием параллельно с проектом Геном человека с 1999 года.

Геном человека

Отличия генома человека, полученного в 2001 и в 2003 годах: было закончено 99% ген-содержащих областей генома (а черновой 90%); точность не более 1 ошибки на 10 тыс. позиций (в ошибка на 1000); пробелов осталось 400, а было 150 тыс; размер самой длинной непрерывной строки 27 млн позиций (ранее около 80 тыс); оставшиеся 1,5% длины генома и 400 брешей будут закрываться вне рамок обще- мирового скоординированного проекта

Общие характеристики генома человека: длина ДНК в вытянутом состоянии почти 2 метра; число нуклеотидов примерно 3 (109 ); число хромосом 23 (первая самая большая, последняя самая маленькая).

Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту: метод химической деградации В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца.

Препарат меченной ДНК разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилирование адениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины.

Автоматическое секвенирование ДНК В основе автоматического секвенирования метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP (*). Автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза.

Методы секвенирования нового поколения техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабар и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.

Основные принципы всех методов СНП Все основные принципы работы технологий СНП базируются на секвенировании ДНК-чипов, используя интерактивные циклические ферментативные реакции с дальнейшим сбором полученной информации в виде иллюстраций. Полученные данные используются для восстановления нуклеотидной последовательности или, как для технологии SOLiD, динуклеотидных «цветов». Несмотря на разные методы получения копий (амплификация) участков генома и на техническую разницу дифференциации различных нуклеотидов в прочтённых последовательностях, общая схема работы для всех секвенаторов одна.

СНП I этап секвенирования создание библиотеки случайных последовательностей ДНК, которые можно будет сшить с общедоступными адаптерными последовательностями. II этап создание ампликонов с помощью ПЦР, которые будут использованы как образцы. III этап определение первичной структуры всех фрагментов.

Сравнение различных методов СНП метод принцип длина одного прочтения, пар оснований стоимость секвенирования 1 млн пар оснований стоимость секвенатора время работы за цикл количество прочтений за цикл преимущества недостатки 454 Life Sciences про секвенирование 40010$ $7 часов длина прочтённых геномных участков; скорость стоимость; погрешностьь Illumina- SOLEXA SBS (sequncing- by-synthesis) 3000,050,15$ $9 дней до эффективность, стоимость скорость IonTorrent ионный полупровод ник 2001$50 000$1,5 часа до стоимость; скорость погрешностьь SOLiD секвенирование на основе лигирования 35500,13$ $9 дней стоимость скорость HelicosHeliScope29002$1 час длина прочтённых геномных участков; скорость низкая производительность при желаемой малой погрешность и; стоимость

Литература Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Москва: Мир, с. ISBN 503 Sanger F., Niclein S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA Т. 74. С. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase // J Mol Biol Т. 94. С.