Метод ПЦР и ИФА в диагностике инфекционных заболеваний

ПЦР – метод амплификации, т.е. получения большого числа копий нужного гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь для получения нужной ДНК содержит: исследуемую ДНК-матрицу, субстраты реакции – 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную Taq-полимеразу и реакционный буфер (кофактор – Mg 2+ ). В 1983 году Кэри Мюллис с сотрудниками разработал метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Праймеры – это искусственно синтезированные короткие однонитевые ДНК (20 – 30 нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок» при ферментативном синтезе ДНК. В ПЦР обычно используют 2 праймера, которые комплементарны 3'- концевым последовательностям амплифицируемого участка на обеих нитях ДНК-матицы соответственно. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых фрагментов ДНК. Термостабильные бактерии Termus Aquaticus

В один цикл ПЦР включается 3 этапа: Денатурация – исходная смесь нагревается до 94°С, при этом нити ДНК расходятся; Отжиг – на этом этапе Т реакционной смеси снижается до 52 – 60°С и происходит комплементарное связывание праймеров с нитями матричной ДНК; Полимеризация, в ходе которой Taq-полимераза катализирует удлинение праймеров (с 3'-конца) и синтез новых цепей ДНК. Т смеси для проявления оптимальной активности Taq-полимеразы соответствует 72°С.

Современный амплификатор Corbett (вид 1) Эти этапы повторяются многократно в приборе – амплификаторе (термоциклере), что позволяет получить огромное количество копий нужного фрагмента ДНК. Так, в результате проведения 20 циклов ПЦР анализируемый участок ДНК амплифицируется более чем в миллион раз.

Современный амплификатор Corbett (вид 2)

Общая схема амплификации изучаемого фрагмента ДНК

Широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявлять этиологию инфекции, даже если в пробе содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, клещевого энцефалита, туберкулеза, венерических заболеваний и т.д. Этот метод имеет большое значение для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях. Определение «вирусной нагрузки» позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов. При помощи ПЦР удается выявить отдельные субтипы и штаммы вирусов и бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к тем или иным лекарственным препаратам.

Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Такой подход является наиболее информативным при диагностике внутриклеточных паразитов и медленнорастущих микроорганизмов, требующих сложных условий культивирования, например, возбудителей туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis.

В качестве примера для идентификации микобактерий группы туберкулеза можно привести праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 н.п. (нуклеотидных пар) мигрирующего элемента IS-986, содержащегося в геноме M. tuberculosis в числе 2 – 8 копий. Последовательность праймеров: INS1 5' - CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC - 3' INS2 5' - GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA - 3'

Амплифицированный фрагмент выявляют в процессе электрофореза в 1,6 % агарозном геле

среди методов диагностики инфекционных возбудителей ПЦР обладает наиболее высокими показателями чувствительности и специфичности (для Ампли-Сенс ПЦР- систем – 1000 микроор-мов/1 мл); возможность использования разнообразного клинического материала; возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования; Достоинства метода ПЦР:

повышенная стабильность при транспортировке, т.к. нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде; скорость проведения анализа (иногда < 24 ч.); точное определение этиологии инфекции; определение количества возбудителя, это особенно актуально для условно-патогенных микроорганизмов, которые вызывают патологию только при определенных условиях; проведение контроля за течением инфекционного процесса. С другой стороны, метод ПЦР, как и любой другой тест молекулярной диагностики, во многом зависит от правильности забора и транспортировки исследуемого материала.

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. В настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

Основной принцип ИФА

96 ячеечный микропланшет, используемый для постановки ИФА

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса; 2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания; 3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

Виды ИФА Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA) Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах. Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA) Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа. Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay) В данном варианте иммуноанализа используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

Расшифровка результатов анализа Иммуноферментный анализ крови позволяет выявить антитела разных видов. Это иммуноглобулины класса А, М, G. Накопление данных антител происходит в различные промежутки времени. Например, первыми после начала заболевания (на пятый день) начинают накапливаться иммуноглобулины класса М. Эти иммуноглобулины циркулируют в организме примерно 5-6 недель, после чего постепенно исчезают. В этот временной промежуток и выявляются иммуноглобулины данного класса. Примерно через 3-4 недели после заболевания появляются иммуноглобулины G, которые могут задерживаться в организме человека в течение нескольких месяцев. Однако этого может и не отмечаться. При проведении иммуноферментного анализа может отмечаться возрастание иммуноглобулинов G, что свидетельствует о наличие инфекционного процесса или реинфекции. Иммуноглобулины А обнаруживаются в крови на протяжении 2-4 недель, однако всего 20% из них находятся в сыворотке крови, остальные 80% содержатся в секрете слизистых оболочек. Как правило, антитела класса А исчезают в период времени от 2 недель до 2 месяцев. Такая динамика свидетельствует об уничтожении инфекционного процесса. Если же после выздоровления результат иммуноферментного анализа все равно показывает наличие иммуноглобулинов А, то это свидетельство хронизации инфекционного процесса.крови

Преимущества иммуноферментного анализа Преимущества иммуноферментного анализа высокая чувствительность и точность метода; возможность проведения ранней диагностики, поскольку ИФА позволяет определять классы иммуноглобулинов при анализе; прослеживание динамики инфекционного процесса; возможность получения быстрого ответа; удобство метода. Недостатки Недостатки Основным недостатком иммуноферментного анализа является тот факт, что в редких случаях метод выдает ложноотрицательные или ложноположительные результаты.

Сравнение двух методов Характеристика метода ПЦРИФА Биоматериал Цена Мазок / кровь Выше