1. Открытие ПЦР. 2. Проведение ПЦР. 3. ПЦР в медицине 4. ПЦР-диагностика туберкулеза 5. Преимущества ПЦР при диагностике инфекций 6. Недостатки ПЦР при диагностике инфекций

Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР, Polymerase chain reaction, PCR) был разработан Кэри Мюллисом (фирма «Cetus», США) в 1983 г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет. За разработку ПЦР-анализа К.Мюллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии. Полимеразная цепная реакция - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Появление метода ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики, прежде всего расшифровкой нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. Нельзя не сказать, что ПЦР стала возможной благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этой полимеразы заключается в ее исключительной термостойкости (выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности) и высокой рабочей температуре (оптимум работы 72 оС). Термостабильные бактерии Termus Aquaticus Taq-ДНК-полимераза

Полимеразная цепная реакция

Праймеры – это искусственно синтезированные короткие однонитевые ДНК (20 – 30 нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок» при ферментативном синтезе ДНК. В ПЦР обычно используют 2 праймера, которые комплементарны 3'-концевым последовательностям амплифицируемого участка на обеих нитях ДНК-матрицы соответственно. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых фрагментов ДНК.

В один цикл ПЦР включается 3 этапа: Денатурация – протекает при в течение 3040 сек, при этом нити ДНК расходятся; Отжиг – Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 5065 о С. Время отжига 2060 сек; Полимеризация, в ходе которой Taq-полимераза катализирует удлинение праймеров (с 3'-конца) и синтез новых цепей ДНК. Температура смеси для проявления оптимальной активности Taq-полимеразы соответствует 72°С.

Современный амплификатор Corbett (вид 1) Эти этапы повторяются многократно в приборе – амплификаторе (термоциклере), что позволяет получить огромное количество копий нужного фрагмента ДНК. Так, в результате проведения 20 циклов ПЦР анализируемый участок ДНК амплифицируется более чем в миллион раз.

Современный амплификатор Corbett (вид 2)

Общая схема амплификации изучаемого фрагмента ДНК

Амплифицированный фрагмент выявляют в процессе электрофореза в агарозном геле Учет результатов: гель помещают на стекло трансиллюминатора. При его освещении ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно- оранжевого цвета. Наличие полосы, характерной по форме и расположению для полосы положительного контроля свидетельствует о том, что в клиническом образце присутствует искомая ДНК. При отсутствии такой полосы или ее размытости и смещении результат принимают за отрицательный или проводят повторное исследование

В медицине эффективно используется полимеразная цепная реакция: В пульмонологической практике – для дифференциации бактериальных и вирусных видов пневмонии, туберкулёза. В гинекологической и урологической практике – для определения уреаплазмоза, хламидиоза, микоплазменной инфекции, гарднереллеза, герпеса, гонореи. В гастроэнтерологической практике - выявления геликобактериоза. В гематологии – для определения онковирусов и цитомегаловирусной инфекции. В экспресс-диагностике таких инфекционных заболеваний как вирусные гепатиты, дифтерия, сальмонеллёз.

Диагностика методом ПЦР позволяет использовать для анализа различный биологический материал: кровь, плазма, сыворотка; биологические жидкости ( сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна) ; моча; мокрота; биоптаты ( желудка и двенадцатиперстной кишки); соскоб эпителиальных клеток.

ПЦР-диагностика туберкулеза Развитие туберкулезной инфекции вызывают 4 вида микобактерий (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum и Mycobacterium microti), поэтому в последние десятилетия интенсивно развиваются молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза, определения лекарственной устойчивости и типирования штаммов микобактерий туберкулеза.

ПЦР-диагностика туберкулеза Как правило, строится на использовании последовательностей ДНК, специфичных для всех 4 видов группы туберкулеза. Часто для этих целей используют праймеры для выявления последовательностей IS-элементов, например, IS-986 или IS-6110, т.к. данные мигрирующие элементы характерны только для видов микобактерий туберкулеза и присутствуют в геноме микобактерий в числе нескольких копий.

В качестве примера для идентификации микобактерий группы туберкулеза можно привести праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 н.п. (нуклеотидных пар) мигрирующего элемента IS- 986, содержащегося в геноме M. tuberculosis в числе 2 – 8 копий. Последовательность праймеров: INS1 5' - CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC - 3' INS2 5' - GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA - 3'

Преимущества метода ПЦР: Универсальность: данный анализ позволяет выявить различные ДНК и РНК тогда, когда другие методы исследования не работают. Позволяет определить не только наличие возбудителя, его тип, а также количественное соотношение данного микроорганизма. Высокая специфика (точность 100%).Это значит, что в процессе исследования определяется последовательность нуклеотидов, характерная для отдельно взятого микроорганизма. К тому же, оборудование позволяет определить наличие других возбудителей в том же материале, и это никак не влияет на точность и качество ответа. Высокая чувствительность к выявлению возбудителей инфекции. Выявить микроорганизм возможно даже при минимальном содержании ДНК в биологическом материале.

Преимущества метода ПЦР: ПЦР анализ выявляет именно наличие инфекции, а не реакцию организма на нее. Поэтому определить наличие патогенных организмов можно еще в состоянии сна инфекции или в инкубационном периоде. Многие болезнетворные культуры очень сложно культивировать в пробирке другими методиками, а полимеразная реакция позволяет размножить культуру в нужном количестве. Быстрота проведения диагностики. Процесс занимает всего несколько часов, поэтому результат пациент сможет получить уже на следующий день. Небольшой объем материала, нужного для исследования. Возможность получить результат, использовав минимальный объём пробы, очень важна для педиатрических, неантологических, неврологических исследований, а также в практике судебной медицины.

Недостатки метода ПЦР: Результат анализа во многом зависит от того, как проводилось исследование и в каком помещении. Из-за высокой чувствительности в материал могут проникнуть чужеродные микроорганизмы из внешней среды, поэтому в лабораториях обязательны биологические фильтры воздуха с высокой степенью фильтрации. Брать анализ и оценивать результаты должен исключительно лечащий врач. Это важно потому что не всегда положительный результат является заболеванием. Возможно, пациент уже прошел курс лечения, а инфекция и возбудители удаляются из организма не сразу. И, конечно, от правильности взятия анализа зависит точность ответа. Проводить анализ обязан только врач, который имеет квалификацию и четкие инструкции от лаборатории по взятию материала для пцр анализа.